吕　斐，马民安，王志宏，苏远科，罗　晓，胥　洪

（龙口出入境检验检疫局，山东烟台　265700）



液相色谱-串联质谱法测定葡萄干中赭曲霉毒素A含量

吕斐，马民安，王志宏，苏远科，罗晓，胥洪

（龙口出入境检验检疫局，山东烟台265700）

建立葡萄干中赭曲霉毒素A（OTA）的液相色谱-串联质谱测定方法。样品经甲醇超声提取，以乙腈-水（含0.1%甲酸）为流动相，进行梯度洗脱，正离子多反应监测模式（MRM）测定。结果表明，赭曲霉毒素A在1～50 μg/L范围内有良好的线性，相关系数R2＞0.999，方法回收率为79%～96%，相对标准偏差为3.1%～4.8%，定量限1.0 μg/kg。该方法前处理快速简单，可用于对进出口葡萄干中赭曲霉毒素A的检测。

葡萄干；赭曲霉毒素A；液相色谱-串联质谱法

0　引言

赭曲霉毒素A（英文简称OTA）为真菌的次级代谢产物，可从谷类、干果制品、饲料、肉类及制品、奶制品、药用植物、人血中检出。试验表明，OTA具有严重的肾毒性、肝毒性、神经毒性以及免疫毒性［1-4］。2008年，波兰发出中国产葡萄干中OTA含量超标（20.7 μg/kg） 的预警通报，导致货物扣留，造成较大经济损失，给我国该食品行业出口造成不利影响。随后，各国相继对葡萄干中OTA规定了严格的限量要求，如欧盟科学委员会规定葡萄干中OTA的最高含量为10 μg/kg。

赭曲霉毒素A化学结构式见图1。

目前，国内葡萄干中OTA的检测标准有SN/T 1940—2007进出口食品中赭曲霉毒素A的测定方法，其采用免疫亲和柱净化、高效液相色谱法分析，基质干扰较大，且免疫亲和柱价格昂贵、成本较高。

图1　赭曲霉毒素A化学结构式

近年来，由于液相色谱-串联质谱（LC-MSMS）技术具有灵敏度高、抗基质干扰能力强、定性准确等优点，在化学残留物检测方面的应用越来越广泛。本文采用液相色谱-串联质谱结合溶剂直接提取，建立了葡萄干中赭曲霉毒素A残留量的测定方法。该方法操作简便、成本较低，省略液液分配、免疫亲和柱净化等步骤，可以满足残留监控和风险评估的要求。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

Agilent 1290型高效液相色谱仪、Agilent 6460型三重四级杆质谱仪（配有电喷雾离子源（Jet-ESI））、Masshunter色谱工作站；十万分之一电子天平，瑞士Mettler Toledo公司产品；KQ3200型超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司产品；超纯水机，美国Millipore公司产品。

赭曲霉毒素A标准品，购自美国Sigma公司；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，德国Merck公司产品。

1.2试验方法

1.2.1液质分析条件

（1）色谱条件。AgilentZORBAXEclipsePlusC18型色谱柱（2.1 mm×50 mm，3 μm）；柱温35℃；流动相A为乙腈、B为0.1%甲酸水溶液；梯度程序为0～1 min 40%A，1～3 min从40%A线性增加至60% A，3～4 min 95%A，4～4.1 min由95%A降至40%A，4.1～5 min 40%A；进样量10 μL；流速0.3 mL/min。

（2）质谱条件。电喷雾离子源（Jet-ESI），正离子（ESI+）多反应检测（MRM）模式，喷雾电压4kV，干燥气及雾化气均为氮气，干燥气体温度350℃，干燥气流量10 L/min，雾化气压力45 psi，裂解电压100 V。

1.2.2标准溶液配制

准确称取10 mg赭曲霉毒素A标准品，用甲醇溶解配制成质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，在-18℃下冷冻避光保存，有效期3个月。

取1.0 mL的上述标准储备液，用甲醇配成质量浓度为1.0 g/mL的标准工作液，待用，-4℃下避光保存，有效期1个月。

取适量的标准工作液，用空白葡萄干样品基质配成质量浓度为1，2，5，10，50 μg/L的系列标准溶液，现用现配。

1.2.3样品制备

取葡萄干（约500 g）用食品粉碎机粉碎后，制成试样备用。称取5.00 g样品于50.0 mL聚四氟乙烯离心管中，加入20.00 mL甲醇，超声15 min。随后在离心机中以转速4 000 r/min离心5 min，吸取10.00 mL上清液至50 mL鸡心瓶中，在35℃水浴旋蒸至干。加入乙腈和0.1%甲酸水溶液（配比为4∶6）2.00 mL溶解，涡旋，过0.2 μm微孔滤膜，待仪器测定。

2　结果与讨论

2.1液相条件优化

2.1.1提取溶剂的选择

赭曲霉毒素A是一种稳定的无色结晶化合物，呈弱酸性，易溶于极性溶剂和碳酸氢钠溶液，微溶于水，在甲醇中溶解后可在冰箱中保存1年。本试验为了提高OTA的提取效率、减少干扰，分别考察了70%甲醇，80%甲醇，纯甲醇作为提取溶剂。结果表明，采用纯甲醇为提取溶剂时，测定的干扰最少，待测物的回收率最高，故最终选用纯甲醇作为最终提取溶剂。

不同提取溶剂的回收率对比见表1。

表1　不同提取溶剂的回收率对比

2.1.2提取液优化与配比

将葡萄干空白样品以及加标样品对比，空白样品中存在与OTA保留时间靠近的干扰峰，在加标后，干扰峰被OTA峰覆盖，导致定量检测不准确。为了提高OTA的分离效果，消除葡萄干基质的干扰，选择用梯度洗脱程序进行优化。

葡萄干空白样品色谱见图2，葡萄干加标样品色谱见图3，色谱梯度条件见表2。

图2　葡萄干空白样品色谱

图3　葡萄干加标样品色谱

表2　色谱梯度条件

2.1.3流动相的选择

甲酸流动相色谱见图4，乙酸铵流动相色谱见图5。

图4　甲酸流动相色谱

图5　乙酸铵流动相色谱

流动相的组成不仅影响目标化合物的色谱行为，而且还会影响其离子化效率。本方法采用乙腈和水作为流动相，但当流动相为乙腈-水时，出现了OTA峰拖尾的现象。所以，考虑添加甲酸或乙酸铵改善。结果发现，加入甲酸后能减少峰拖尾现象，并能提高目标分子的离子化效率，使质谱的灵敏度提高，响应值和峰形均优于乙酸铵，且甲酸的浓度在0.1%时，流动相pH值为3.5，OTA的保留时间差异和分离度较为满意。试验又比较了甲醇-水（含0.1%甲酸）和乙腈-水（含0.1%甲酸） 作为流动相，相较于甲醇-水（含0.1%甲酸）体系，OTA在乙腈-水（含0.1%甲酸）体系中峰宽更小、对称性更好，出峰时间也靠前。因此，试验采用乙腈-水（含0.1%甲酸）作为流动相。

2.2质谱条件优化

根据OTA分子的化学电离性质，选择ESI+作为电离模式，干燥气体温度350℃，干燥气流速10 L/min，鞘气温度350℃，鞘气流速12 L/min，毛细管电压4 000 V，碰撞气高纯氮（纯度≥99.999%）。

采用针泵直接进样方式确定赭曲霉毒素A的母离子，用于定性分析的离子对为m/z 404.2/358.2和m/z 404.2/239，其中定量分析离子为m/z 404.2/358.2。由于结构的不同，各自产生碎片离子所需要的碰撞能量都不同，在此条件下，能够获得较好的响应。

MRM分析的质谱参数见表3，赭曲霉毒素A的质谱见图6。

表3　M R M分析的质谱参数

2.3标准曲线、线性范围及定量限

用空白葡萄干样品基质配制质量浓度为1，2，5，10，50 μg/L的标准工作液，按上述色谱条件进行分析，得出不同标准工作液质量浓度对应的峰面积，所得峰面积（Y）对质量浓度（X）做图，计算回归方程式和相关系数。

图6　赭曲霉毒素A的质谱

质量浓度与峰面积值见表4，OTA标准曲线见图7。

表4　质量浓度与峰面积值

图7　O TA标准曲线

回归方程为Y=1.084 8X+0.238 4，R2=0.999 7。回归方程表明，赭曲霉毒素A在质量浓度为1～50 μg/L范围内，峰面积与质量浓度成良好线性。

按照本方法测定，根据葡萄干样品能可靠测得的最低质量浓度确定本方法对赭曲霉毒素A的定量限（LOQ，S/N=10）为1.0 μg/kg，这一数值低于国内、国外对葡萄干赭曲霉毒素A的限量标准。

2.4方法学考察

2.4.1回收率试验

取适量赭曲霉毒素A标准溶液添加至空白葡萄干样品中，使添加量相当于1，10，50 μg/kg，且每个水平各6份，进行样品处理、上机，计算回收率。

方法回收率见表5。

由表5可知，回收率为79%～96%，本方法准确度良好。

2.4.2精密度试验

方法精密度见表6。

每个加标水平平行测定6次，相对标准偏差为3.1%～4.8%，表明本方法精密度良好。

2.4.3实验室间验证

实验室间赭曲霉毒素A验证回收率见表7。

选择系统内5家实验室，在空白葡萄干样品中添加3个水平的赭曲霉毒素A标准溶液，进行测定回收率，表明方法可靠。

表5 方法回收率

表6 方法精密度

表7　实验室间赭曲霉毒素A验证回收率

3　结论

相较于高效液相色谱结合免疫亲和柱检测方法，本试验采用甲醇提取，省去了使用昂贵的免疫亲和柱净化的步骤，大大降低了试验成本。直接提取上机也减少了前处理过程中OTA的损失，使得方法的回收率提高，3个水平的平均添加回收率在79%～96%，相对标准偏差为3.1%～4.8%，方法精密度良好，可作为进出口葡萄干中赭曲霉毒素A含量的准确定量方法，能满足残留监控和风险评估的要求。

［1］郝俊冉，许文涛，黄昆仑.赭曲霉毒素A生成转化及致毒机制的研究进展 ［J］.食品工业科技，2012（12）：427-433.

［2］张爱华，冯璐璐，马彦娜，等.赭曲霉毒素A分析方法研究进展 ［J］.中国公共卫生，2012（7）：1 003-1 008.

［3］贾欣，徐诗涵，梁志宏，等.赭曲霉毒素A的微生物脱毒研究进展 ［J］.生物技术通报，2014（12）：18-23.

［4］夏凯，贺晓云，郝俊冉，等.基于核磁共振扫描（NMR）的赭曲霉毒素A毒性血浆代谢组学研究 ［J］.农业生物技术学报，2013（12）：1 426-1 433.◇

Determination of Ochratoxin A in Raisin by LC-MS-MS

LV Fei，MA Min'an，WANG Zhihong，SU Yuanke，LUO Xiao，XU Hong
（Longkou Entry Exit Inspection and Quarantine Bereau，Yantai，Shandong 265700，China）

A confirmative method is developed for determining ochratoxin A（OTA）in raisin by liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry.The sample is treated by ultrasonic extraction with methol.Mobile phase is a blend solution consists of acetonitrile and water（0.1%formic acid） .The separation is carried out with gradient elution.The deteIction is achieved in the positive chemical ionization and multi-reaction monitoring（MRM）mode.Results show that with the optimized condition，a good linearity（R2＞0.999）is achieved for the target compounds in the range of 1～50 μg/L.The overall recoveries ranged from 79%～96%，and the relative standard deviations（RSD）are between 3.1%and 4.8%，the limits of quantification of OTA analytes are 1.0 μg/kg.The results show that the method is simple，accurate and suitable for the determination of OTA in raisin.

raisin；ochratoxin A；liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS-MS）

TS201.6

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.015

1671-9646（2016）07a-0051-04

2016-04-28

吕斐（1982— ），女，本科，工程师，研究方向为食品检测。