佟世生，王丽，靳静言，崔忠义，刘萍，*（.北京城市学院生物医药学部，北京00083；.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京00083）

酶解咖啡鲜果对烘焙咖啡饮用品质和化学成分的影响研究

佟世生1，王丽1，靳静言2，崔忠义2，刘萍1，*
（1.北京城市学院生物医药学部，北京100083；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

选用不同种类的酶对云南小粒咖啡去皮鲜果进行酶解，确定胃蛋白酶最适于制备麝香猫咖啡，随后进行了胃蛋白酶酶解咖啡鲜果的条件优化，确定最佳酶解条件为胃蛋白酶添加量1%，酶解2h，酶解温度55℃，此时感官评分为13.5分，高出未处理咖啡鲜果的感官评价结果1倍。同时研究酶解对咖啡鲜果中主要化学成分的影响，及其对咖啡鲜果烘焙后饮用品质的作用。

咖啡鲜果；酶解；相关性分析；云南小粒咖啡

麝香猫咖啡（Civet coffee），是咖啡鲜果被麝香猫（Civet）吃下，经过消化道消化后排泄出的咖啡生豆，具有特殊风味，但产量极低。Massimo［1］对天然麝香猫咖啡进行压缩试验发现，它们与未经麝香猫吞食的咖啡豆相比质地更坚硬且易碎，这表明麝香猫胃液渗透到了咖啡豆内部，胃蛋白酶或胰蛋白酶类蛋白酶可能通过内果皮对内部易感蛋白进行水解以改变咖啡烘焙后感官品质。Vandenberghe［2］等利用阿拉比卡咖啡模拟麝香猫咖啡时，使用盐酸将消化环境调为1.5～2之间，并使用猪胃黏膜的胃蛋白酶（每克蛋白粉包含1 000个胃蛋白酶单位）进行酶解处理。天然麝香猫咖啡的生产过程大致如下：麝香猫将咖啡鲜果完整吞食，鲜果经由肠胃消化，最终由粪便排出。消化系统中大致包括两个过程：一是肠胃中酶的水解处理，二是肠胃中微生物的发酵处理。麝香猫咖啡作为目前世界上生产成本最昂贵的咖啡品种，其生产过程受到麝香猫自身活动周期的限制。而近年来不断出现将麝香猫消化系统作为机械咖啡发酵机的行为，也受到了一些动物保护者的抨击。酶解咖啡的文献资料中所使用过的酶包括淀粉酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶、葡聚糖酶、体外蛋白酶、体内蛋白酶、磷酸酯酶、植酸酶、磷脂酶、酯酶、核酸酶等。Mun［3］等使用胃蛋白酶对未经烘焙的咖啡生豆进行酶解以优化其风味品质，将未烘焙的咖啡生豆浸泡在pH为1.5～2的酸性液体中，该酸性溶液中包含胃蛋白酶，浸泡90 min至24 h。处理后的咖啡豆苦果味有所减少，整体口感与香气有所提升。

研究中使用不同消化酶对云南小粒咖啡鲜果进行酶解，并对处理后的咖啡进行烘焙，通过感官评价和理化指标的检测，筛选出能够有效提高咖啡豆烘焙品质的消化酶类，分析消化酶对咖啡豆中主要化学成分的影响，同时对烘焙咖啡豆中主要化学成分与感官评价之间的相关性进行分析。

1　材料与方法

1.1材料与设备

1.1.1材料与试剂

咖啡鲜果：2013年11月产自云南保山地区的云南小粒咖啡鲜果；糖化酶（40U/mg）、果胶酶（150U/mg）、α-淀粉酶（500 U/mg）、纤维素酶（700 U/g）、胃蛋白酶（250 U/mg）、胰蛋白酶（10 000 BAEE U/mg）：Sigma公司；3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠（均为分析纯）：北京化工厂；偏重亚硫酸钠、苯酚、酒石酸钾钠、氧化镁（均为分析纯）：西陇化工股份有限公司；葡萄糖标品（色谱纯）：上海市易欣生物科技有限公司；咖啡因标品、绿原酸标品、葫芦巴碱标品（色谱纯）：贵州迪大生物科技有限公司。

1.1.2主要仪器设备

KQ3200DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DZKW-C型恒温水浴锅：北京中科星宇商贸有限公司；GENECAFÉ CBR-101咖啡烘焙机：Genesis Co.，Ltd；TSK-1171型滴漏式咖啡机：灿坤实业有限公司；TDL-40C型台式离心机：上海安亭科学仪器厂；TFG-G型通风橱：广州佳镁铧实验设备有限公司；LX-C50L型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；DNP-9272型电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；PB-10型pH计：德国Sartorius公司。

1.2方法

1.2.1烘焙咖啡饮用品质评定

本试验参考International Coffee Organization（Ico）国际标准、Cup of Excellence（Coe）感官评定细则及巴西式咖啡评分制度，结合实验室人员多年咖啡品评经验，制定出一套烘焙咖啡杯测评分方法（表1）。将每个指标设置为4个等级，邀请经过训练的5名评价员组成评价小组对样品进行客观评价。感官评分的计算公式为：

感官评分总分=苦味+酸味+香味+余味+甜味+糊味+果味+顺滑+醇厚（1）

表1　烘焙咖啡杯测评分标准Table 1　Evaluation standard of roasted coffee cupping

1.2.2烘焙咖啡蛋白质含量的测定

云南小粒咖啡鲜果烘焙样品中蛋白质含量的测定方法采用GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。

1.2.3烘焙咖啡还原糖含量的测定

取7支25 mL具塞试管，分别加入0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的1 mg/mL已配制好的葡萄糖标品，用蒸馏水补足至2.0 mL，加入1.5 mL DNS试剂，塞好试管，沸水浴加热7 min，以空白样品为参比，测定540 nm波长下的吸光值，绘制还原糖标准曲线（图1），计算出一元线性回归方程。还原糖标准曲线为y=4.7235x-0.030 5，其中x为葡萄糖浓度，y为吸光度，相关系数R2=0.993 0。

图1　还原糖标准曲线Fig.1　The standard curve of reducing-sugar

精确称取烘焙咖啡样品0.2 g置于20 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，置于50℃水浴锅中加热40 min，不定时摇匀，水浴结束后趁热过滤得到浸提液。取待测液及空白对照各2 mL于25 mL具塞试管中，加入1.5 mL DNS显色剂，塞好试管，沸水浴7 min之后冷却。测定540 nm波长下的吸光值，根据标准曲线的线性方程计算出烘焙咖啡样品中还原糖的含量，整个试验的操作时间控制在2 h之内。

1.2.4烘焙咖啡绿原酸含量的测定

精确称量20 mg色谱纯的绿原酸标准品，用蒸馏水定容至50 mL，取上述溶液1 mL定容至25 mL，配制成绿原酸标准溶液。依次精确称取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用蒸馏水补足至1.0 mL。测定330 nm波长下的吸光值。绘制出绿原酸标准曲线，计算出一元线性回归方程。得到绿原酸标准曲线为y= 0.703 4x-0.005 0（图2），其中x为绿原酸标品含量，y为吸光度，相关系数R2=0.999 7。

图2 绿原酸标准曲线Fig.2　The standard curve of chlorogenic acid

精确称取2.0 g烘焙咖啡样品和0.4 g β-环糊精于具塞三角瓶中，加入30 mL蒸馏水混合均匀，置于70℃恒温水浴锅中水浴30 min之后取出，过滤后将滤液在4 000 r/min转速下离心5 min，取上清液备用。取1mL上清液置于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。测定330 nm波长下的吸光值，测定前将样品稀释10倍，根据标准曲线的线性方程计算出烘焙咖啡样品中绿原酸的含量。

1.2.5烘焙咖啡咖啡因和葫芦巴碱含量的测定

反相HPLC测定烘焙咖啡样品中咖啡因和葫芦巴碱的含量，分离柱为Agilent Eclipse XDB-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm。流动相为磷酸缓冲液（20 mmol/L，pH 4.3）∶乙腈=9∶1，流动相速度为1 mL/min，柱温设置为25℃，进样量20 μL，检测波长254 nm。

咖啡因和葫芦巴碱标准曲线的测定：准确称取20 mg色谱纯的咖啡因和葫芦巴碱标准品，用蒸馏水溶解于25 mL容量瓶中。取上述溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于1.5 mL离心管中，用蒸馏水补足至 1 mL，所得浓度依次为0.04、0.08、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 mg/mL，用0.45 μm无机相滤头过滤。使用反相HPLC方法测定烘焙咖啡样品中咖啡因和葫芦巴碱含量。得到葫芦巴碱标准曲线为y=13 468x+ 1.355 7（图3），其中x为葫芦巴碱标品含量，y为峰面积，相关系数R2=0.999 9。咖啡因标准曲线为y= 74 974x+74.575（图4），其中x为咖啡因标品含量，y为峰面积，相关系数R2=0.999 8。

图3　葫芦巴碱标准曲线Fig.3　The standard curve of trigonelline

图4 咖啡因标准曲线Fig.4　The standard curve of caffeine

烘焙咖啡样品中咖啡因和葫芦巴碱含量的测定方法：精确称取研磨好的烘焙咖啡样品1.0 g，同时称取4.5 g氧化镁，将两者混匀于100 mL水中，90℃水浴加热20 min，水浴过程中不停搅拌。冷却后将体积补足，过滤后稀释5倍，用0.45 μm的无机滤头过滤。根据标准曲线的线性方程计算出烘焙咖啡样品中咖啡因和葫芦巴碱的含量。

1.2.6咖啡豆的烘焙工艺

准确称取100 g咖啡豆，置于咖啡烘焙机中进行烘焙。初始温度150℃，之后以5℃/min的速度进行梯度升温，当温度达到250℃时恒温烘焙5 min。烘焙结束后粉碎，置于低温避光环境下保存以备用。

1.2.7酶种类对酶解咖啡鲜果饮用品质和化学成分的影响

称取50 g剥去外果皮的云南小粒咖啡鲜果置于4号自封袋中，按0.5%酶添加量分别将糖化酶（pH 5.0，酶解温度55℃）、果胶酶（pH 4.0，酶解温度55℃）、α-淀粉酶（pH 6.0，酶解温度50℃）、纤维素酶（pH 4.5，酶解温度50℃）、胃蛋白酶（pH 1.6，酶解温度55℃）和胰蛋白酶（pH 7.5，酶解温度55℃）充分溶解于无菌水后倒入自封袋中，按袋中液体总量占鲜果20%的比例补足无菌水，混匀密封后将自封袋置于对应酶解温度的水浴锅中酶解2 h。酶解结束后将鲜果取出用无菌水迅速冲洗干净，置于70℃烘箱中进行干燥，待其恒重后脱去外壳进行烘焙，研磨以备杯测评分及化学成分的测定。

1.2.8胃蛋白酶酶解咖啡鲜果的条件优化

称取50 g剥去外果皮的云南小粒咖啡鲜果置于4号自封袋中，分别按0.0%、0.5%、1.0%和5.0%添加量将胃蛋白酶充分溶解于无菌水后倒入自封袋中，按袋中液体总量占鲜果20%的比例补足无菌水，在pH 1.6，酶解温度55℃的条件下进行酶解，分别在酶解2、4、6、8 h时取出部分自封袋，酶解结束后将咖啡鲜果用无菌水迅速冲洗干净，置于70℃烘箱中进行干燥，待其恒重后取出脱去外壳进行烘焙，研磨以备杯测评分及化学成分的测定。

1.3数据分析

试验数据使用Excel进行整理，使用Spss 21.0对试验数据进行单因素方差分析和Pearson相关性统计分析。

2　结果与讨论

2.1酶种类对酶解咖啡鲜果烘焙后饮用品质和化学成分的影响

不同酶种类对酶解咖啡鲜果烘焙后饮用品质的影响见图5。

图5　不同酶种类对酶解咖啡鲜果烘焙后饮用品质的影响Fig.5　Cupping score of fresh fruit by different enzyme hydrolysis

从图5中可以看出，胰蛋白酶和胃蛋白酶对于酶解咖啡鲜果杯测品质的提高效果较其他酶更明显，其中胃蛋白酶的提升作用最大，酶解后的烘焙咖啡感官评分为12.2分。较未经酶解的空白样品提高1.03倍。胰蛋白酶酶解咖啡鲜果的烘焙后感官评分为10.1分。较未经酶解的空白样品提高0.68倍。α-淀粉酶对于酶解咖啡鲜果的烘焙后感官评分没有显著提高。果胶酶酶解咖啡鲜果的烘焙后感官评分为7.2分，较胃蛋白酶和胰蛋白酶的提高效果差，说明果胶酶对于咖啡鲜果内部果胶层的水解作用并没有使得咖啡饮用品质得到较大提升。糖化酶酶解咖啡鲜果的烘焙后感官评分为8.3分，较未经酶解处理的云南小粒咖啡鲜果提高38.3%。纤维素酶酶解咖啡鲜果的烘焙后感官评分为8.1分，较未经酶解处理的云南小粒咖啡鲜果提高35.0%。说明利用蛋白酶类对咖啡鲜果进行水解使得内部蛋白质的成分得到调整，从而获得较其他酶种类水解咖啡鲜果效果更好的饮用品质。

不同酶种类酶解咖啡鲜果的烘焙后感官评分细则见图6。

图6　不同酶种类酶解咖啡鲜果的烘焙后感官评分细则表Fig.6　Detailed scores of fresh fruits by different enzymes hydrolysis

结果表明，感官评分最高的胃蛋白酶细则评分中，苦味、酸味、香味、余味、顺滑感和醇厚感评分也为最高值。感官评分为8.3分的糖化酶处理样品的果味和糊味评分均为最高值1.4分和1.5分。感官评分为7.2分的果胶酶处理样品的甜味评分为最高值1.4分。糖化酶、果胶酶、α-淀粉酶和纤维素酶酶解咖啡鲜果较空白样品的苦味评分降低，而这四种酶酶解后的咖啡鲜果感官评分总分也相对较低，说明苦味评分直接影响烘焙咖啡的感官评分总分。酶解处理后咖啡鲜果的酸味、香味、顺滑感和醇厚感评分较空白样品均有所提高，说明酶水解有助于咖啡果酸物质的生成与芳香物质的释放，最终提高烘焙咖啡的整体风味。

不同酶种类酶解咖啡鲜果的烘焙后化学成分表见表2。

表2　不同酶种类酶解咖啡鲜果的烘焙后咖啡化学成分表Table 2　Chemical compositions of fermentated fresh fruits after hydrolysis with different enzymes g/100 g

从表2中可以看出，感官评分最高的胃蛋白酶处理后蛋白质含量为最低值13.403 g/100 g，胰蛋白酶处理后蛋白质含量为15.786 g/100 g，未经酶解处理的空白样品蛋白质含量为23.023 g/100 g。胃蛋白酶处理能够将云南小粒咖啡鲜果蛋白质含量降低41.8%，胰蛋白酶处理能够降低31.4%。说明蛋白质含量的降低提升了烘焙咖啡饮用品质。此外，酶解处理降低了云南小粒咖啡鲜果的还原糖含量，其中胃蛋白酶与胰蛋白酶处理样品的还原糖降低率分别为8.3%和11.9%。酶解处理使得咖啡鲜果葫芦巴碱含量下降，胃蛋白酶酶解样品的葫芦巴碱含量降低率为44.7%。

2.2酶解时间和酶添加量对胃蛋白酶酶解咖啡鲜果烘焙后饮用品质和化学成分影响

胃蛋白酶不同酶解时间和酶添加量酶解对云南小粒咖啡鲜果饮用品质的影响见图7。

结果表明，酶添加量为0.5%和1.0%的感官评分随着酶解时间的增加呈现先上升后下降的趋势，当酶解时间为2 h时，1.0%添加量的酶解效果最佳，感官评分为13.5分，较未经酶解的空白样品提高1.25倍。当酶解时间为4 h时，0.1%添加量的酶解效果达到峰值12.5分，较未经酶解的空白样品提高1.08倍。当酶解时间为6 h时，5.0%添加量的酶解后感官评分随着酶解时间的增加由6.0分提高到9.1分。但5.0%添加量的酶解效果整体低于前三个浓度，说明酶添加量过高可能导致咖啡鲜果中蛋白质发生过度水解，致使烘焙过程中生成芳香风味物质的底物减少，最终导致烘焙后感官评分较低。

胃蛋白酶不同酶解时间和酶添加量酶解云南小粒咖啡鲜果的感官评分细则见表3。

图7　胃蛋白酶不同酶解时间和酶添加量对酶解云南小粒咖啡鲜果饮用品质的影响Fig.7　Cupping score of fresh fruit by pepsin hydrolysis in time and add amount

表3　胃蛋白酶不同酶解时间和酶添加量酶解咖啡鲜果的评分细则表Table 3　Detailed scores of fresh fruits by pepsin hydrolysis in time and add amount

由表3可知，感官评分最高的胃蛋白酶细则评分中，苦味、酸味、香味、余味、顺滑感和醇厚感评分也为最高值。感官评分为8.3分的1.0%酶添加量和4 h酶解时间处理样品的果味评分为最高值1.1分。感官评分为12.5分的0.1%酶添加量和4 h酶解时间处理样品的糊味和甜味评分均为最高值1.7分。随着酶添加量的增加，咖啡鲜果烘焙后苦味评分整体呈现下降的趋势。可能是由于较高酶添加量导致苦味肽的产生被抑制，或高浓度水解物在烘焙过程中与其他化学物质发生反应，减弱了杯测过程中的苦味感知。

胃蛋白酶不同酶解时间和酶添加量对酶解云南小粒咖啡鲜果烘焙后化学成分的影响见表4。

表4　胃蛋白酶不同酶解时间和酶添加量对酶解云南小粒咖啡鲜果烘焙后化学成分的影响Table 4　Chemical compositions of fermented fresh fruits by pepsin hydrolysis in time and add amount

结果表明，感官评分最高的1%酶添加量酶解2 h处理样品蛋白质含量为最低值12.425 g/100 g，较未经酶解处理的空白样品降低46.0%。1.0%酶添加量酶解8 h处理样品蛋白质含量为最高值21.932 g/100 g，较未经酶解处理的空白样品降低47.4%。随着酶添加量的增加，酶解咖啡鲜果的还原糖含量整体呈现下降的趋势。说明酶添加量的增加可能导致烘焙过程中还原糖的消耗增大，而当还原糖消耗到一定程度，感官评分出现下降的趋势。

2.3酶解咖啡鲜果烘焙后感官评分与化学成分的关系

使用SPSS 21.0对不同酶种类酶解云南小粒咖啡鲜果的烘焙后感官评分与化学成分进行Pearson相关性分析，结果见表5。

表5　酶解咖啡鲜果的Pearson相关性分析Table 5　Pearson correlation analysis of fresh fruits by hydrolysis

从表5中可以看出，酶解处理后咖啡鲜果烘焙后感官评分与蛋白质含量呈显著负相关，相关系数为0.858。与咖啡因、绿原酸、还原糖和葫芦巴碱含量无显著相关性。说明烘焙后饮用品质会随着烘焙过程中蛋白质含量的减少而提高。评分细则中苦味、酸味、香味、余味、糊味、顺滑感和醇厚感评分与蛋白质含量呈负相关。说明烘焙过程中蛋白质含量的减少量越大，烘焙咖啡整体风味的比例越趋向平衡。香味、顺滑感、醇厚感评分与葫芦巴碱含量均呈负相关，较高的咖啡因含量会产生丰富的余味、浓重的糊味和愉悦的顺滑感。

3　结论

研究中选用了不同种类的酶对云南小粒咖啡鲜果进行酶解处理，确定胃蛋白酶对咖啡鲜果的品质作用较大，然后对胃蛋白酶的酶解条件进行了优化，确定了最佳酶解条件为胃蛋白酶添加量1%，酶解2 h，此时感官评价结果为13.5分，高出未处理咖啡鲜果的感官评价结果1倍。

通过相关性分析研究酶解处理咖啡豆烘焙后感官评分与化学成分的相关性，得到酶解处理云南小粒咖啡鲜果烘焙后感官评分与蛋白质含量呈显著负相关，相关系数为0.858。烘焙过程中蛋白质含量的减少量越大，烘焙咖啡整体风味的比例越趋向平衡。香味、顺滑感、醇厚感评分与葫芦巴碱含量均呈负相关，较高的咖啡因含量会产生丰富的余味、浓重的糊味和愉悦的顺滑感。

［1］Massimo S R，M A Sanromán.Application of solid-state fermentation to food industry-a review［J］.Journal of Food Engineering，2006，76（3）：291-302

［2］Vandenberghe L P S，Soccol C R，Pandey A，et al.Citric acid production by Aspergillus niger in solid state fermentation［J］.Microbial Technology for Sustainable Development and Productivity，Jabalpur，India，November 1998，2002：227-231

［3］Mun H A，Lum N A，Cruz A S D.Bacteria responsible for mucilagelayer decomposition in Kona coffee cherries［J］.Applied microbiology，1965，13（2）：201-207

Conditions Optimization of Enzymolysis on Coffee Fruit and the Impact Study on Coffee Drinking Quality and Chemical Composition

TONG Shi-sheng1，WANG Li1，JIN Jing-yan2，CUI Zhong-yi2，LIU Ping1，*
（1.Department of Biological Medicine，Beijing City University，Beijing 100083，China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

This paper determined that the best enzyme to processing civet coffee is pepsin，then optimized the coffee fruit pepsin enzymatic hydrolysis conditions，determined the optimum of adding 1%topepsin，enzymatic hydrolysis 2 h，enzymolysis temperature of 55℃，at these conditions the sensory score was 13.5 points，higher than the untreated coffee fruit sensory evaluation results of 1 times.At the same time，study on the effect of enzymatic hydrolysis on the main chemical components in fresh fruit and coffee，drinking coffee fruit quality of baking after effect was investigation.

coffee fruit；enzymolysis；correlation analysis；coffee arabica in Yunnan province

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.013

佟世生（1970—），男（汉），副教授，博士，研究方向：食品科学、农产品贮藏加工。
*

刘萍（1970—），女（满），副教授，博士，研究方向：发酵工程、生物制药。

2015-04-14