颜　娟，郑茂东，崔玉环，赵秀花，班旭霞，赵虹琇

(1.河北北方学院附属第一医院药学部，张家口 075000;2.河北北方学院附属第一医院老年科，张家口 075000)



牡荆苷对小鼠脑缺血/再灌注损伤抗氧化应激作用

颜娟1，郑茂东1，崔玉环2，赵秀花1，班旭霞1，赵虹琇1

(1.河北北方学院附属第一医院药学部，张家口 075000;2.河北北方学院附属第一医院老年科，张家口 075000)

摘要：目的探讨牡荆苷对小鼠脑缺血/再灌注损伤后脑组织中丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性的影响。方法雄性昆明种小鼠70只，随机分为正常对照组、假手术组、模型组、尼莫地平组(0.6 mg·kg-1)、牡荆苷组(10、20、40 mg·kg-1)。采用线栓法制备小鼠脑缺血/再灌注损伤模型，采用试剂盒法测定MDA、NO含量和SOD、NOS活性。结果再灌注24 h后，小鼠脑缺血/再灌注后神经功能评分模型组显著升高(P<0.01)，牡荆苷组显著降低(P<0.05)。模型组脑组织中MDA、NO含量及NOS活性显著升高(P<0.01)，SOD活性显著降低(P<0.01)；牡荆苷组脑组织中MDA、NO含量和NOS活性显著降低(P<0.05)，SOD活性增强(P<0.01)。结论牡荆苷脑保护作用可能是通过抗氧化应激作用实现的。

关键词：牡荆苷；丙二醛；超氧化物歧化酶；一氧化氮；一氧化氮合酶；脑缺血/再灌注

对脑缺血/再灌注损伤的研究发现氧化应激[1]、自由基[2]、细胞凋亡[3]、兴奋性氨基酸[4]等诸多因素参与其中。机体内存在的酶系能够清除自由基,如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)使细胞免受氧化带来的损伤，而丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量不但直接反映脂质过氧化反应的程度和水平，而且间接反映清除自由基的能力[5]。缺血/再灌注损伤机制极为复杂，氧化应激即可直接损伤细胞，导致细胞损伤，还可通过线粒体途径[6]、神经细胞膜结构[7]、溶酶体结构和功能的变化[8]等间接导致细胞凋亡。因此，激活抗氧化系统对抗氧化应激是减轻缺血/再灌注损伤的重要机制。

金莲花是毛茛科植物金莲花的干燥花及花蕾，有消肿明目，清热解毒的功效，临床上主要用于扁桃体炎、上呼吸道感染等。牡荆苷属黄酮碳苷类，是金莲花主要有效成分单体，前期药理实验表明牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠脑损伤具有保护作用[9]。本研究探讨了牡荆苷对小鼠脑缺血/再灌注损伤后脑组织MDA、一氧化氮(nitric oxide，NO)水平和SOD、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性的影响，旨在探讨牡荆苷对脑缺血/再灌注损伤的抗氧化应激作用。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1药品与试剂

牡荆苷由河北北方学院药物研究所提供，纯度>98%；尼莫地平注射剂(nimodipine，Nim)；MDA测定试剂盒、SOD测定试剂盒、NO测定试剂盒、NOS测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；其他试剂均为分析纯。

1.1.2动物

昆明种小鼠70只，体质量22～24 g，雄性，由河北北方学院动物中心提供，实验动物生产许可证号：XCYK(冀)2010-2014。

1.2方法

1.2.1牡荆苷溶液的配制

N，N-二甲基甲酰胺溶解牡荆苷，吐温-80助溶，振荡混匀，加入生理盐水(N，N-二甲基甲酰胺∶吐温-80∶生理盐水=1∶1∶20)。

1.2.2分组及模型制备

70只小鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、尼莫地平组(0.6 mg·kg-1)、牡荆苷(10、20、40 mg·kg-1)组，每组10只。牡荆苷组在缺血/再灌注前连续腹腔给予牡荆苷3 d，缺血/再灌注24 h后取材。小鼠称重后3.5%水合氯醛(10 mL·kg-1)腹腔麻醉，仰卧位固定于手术台上，按文献方法[10]制备脑缺血/再灌注小鼠模型，并于术后48 h阻断两侧颈总动脉造成大脑缺血状态，5 min后恢复血液再灌注。假手术组手术过程与缺血/再灌注组一致，但只暴露颈总动脉，并不进行插线。

1.3神经行为学评分

小鼠苏醒后，观察存活小鼠行为变化，于再灌注24 h后参考Clark评分[11](0～28分)。

1.4MDA、NO含量和SOD、NOS活性的测定

再灌注24 h后立即处死动物，取脑缺血侧2/3脑组织，除去样本表面附属物，生理盐水冲洗3次后，滤纸吸干水分，制成10%脑匀浆，4 000 r·min-1离心10 min，取上清，依次按MDA试剂盒、SOD试剂盒、NO试剂盒、NOS试剂盒方法测定。

1.5统计学方法

2结果

2.1各组小鼠脑缺血/再灌注损伤神经功能缺陷评分比较

假手术组与正常对照组相比，差异无显著性(P>0.05);模型组与假手术组相比神经功能缺陷评分差异有显著性(P<0.01)；牡荆苷10、20、40 mg·kg-1组与模型组相比神经功能缺陷评分差异有显著性(P<0.05)(表1)。

表1 各组小鼠脑缺血/再灌注损伤神经功能缺陷评分比较±s)

注：与假手术组比较*P<0.01；与模型组比较#P<0.01，##P<0.05

2.2各组小鼠脑缺血/再灌注损伤脑组织中MDA、NO含量和SOD、NOS活性比较

与假手术组相比，模型组小鼠脑组织中MDA含量明显升高(P<0.01)；与模型组相比，牡荆苷10、20、40 mg·kg-1组小鼠脑组织中MDA含量降低(P<0.05)。与假手术组相比，模型组小鼠脑组织中SOD活性明显降低(P<0.01)；与模型组相比，牡荆苷10、20、40 mg·kg-1组小鼠脑组织中SOD活性显著增强(P<0.01)。与假手术组相比，模型组小鼠脑组织NO含量、NOS活性显著升高(P<0.01)；与模型组相比，牡荆苷10、20、40 mg·kg-1组脑组织中NO含量、NOS活性显著降低(P<0.05)。假手术组与正常对照组相比，差异无显著性(P>0.05)(表2)。

表2　各组小鼠脑缺血/再灌注损伤脑组织中MDA、NO含量和SOD、NOS活性比较±s)

注：与假手术组比较*P<0.01；与模型组比较#P<0.01，##P<0.05

3讨论

在脑缺血/再灌注过程中，氧化应激损伤、自由基损伤、氧化剂过剩、解毒系统失活、抗氧化剂不足[12]多个环节相互作用。过量的氧自由基作用于细胞膜不饱和脂肪酸及细胞内各种酶发生脂质过氧化反应，使质膜破坏和功能障碍，诱导DNA、RNA、蛋白质交联和氧化反应，引起神经元死亡或凋亡[13]。脑缺血/再灌注时，虽然组织重新获得供氧可缓解脑组织的缺血缺氧状态，但同时也产生大量自由基，使其大量聚集，脑组织损伤进一步加重。在人体正常状态下，体内存在天然的自由基清除系统。SOD是一类金属酶，能将活性氧歧化为O2和H2O2，是内源性自由基清除剂，可通过歧化方式清除自由基，保护细胞免受损伤，因此，机体清除氧自由基的能力可用SOD活力的高低表示。本实验结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠脑组织中MDA含量明显升高，SOD活性明显降低，表明脑缺血/再灌注后氧化产物显著增加，而清除自由基的主要活性酶活性显著下降，抗氧化能力降低；牡荆苷组能够显著降低MDA水平，表明牡荆苷脑保护作用可能因其可减轻脂质过氧化损伤及牡荆苷具有增强SOD活性的作用。

NO是最早发现的参与体内信号转导的气体信号分子，NO也是一种自由基，是新型信使。在正常人体生理条件下，NO对脑具有保护作用，但内源性或外源性NO产生过量则会直接导致神经毒性[14]。NO由L-精氨酸在NOS作用下生成，具有双重作用，即可扩张脑血管、增加脑血流、改善脑缺血症状，又具有抑制线粒体呼吸、损伤DNA和过氧化膜脂质等作用导致神经元损伤[15]。研究表明，NO参与脑缺血/再灌注损伤发生发展的诸多环节[16]。其主要作用机制是NO与氧或超氧自由基反应，生成毒性更大的超氧亚硝酸根，又可进一步降解为NO2和OH自由基，这些产物可引起细胞蛋白质、核酸及脂肪膜损伤，使细胞膜发生脂质过氧化反应，导致大量神经元死亡及脑组织损伤[17]。本实验结果显示脑缺血/再灌注后NO含量升高，NOS活性明显增加，与假手术组相比，模型组NO含量、NOS活性显著升高；与模型组相比，牡荆苷组NO含量、NOS活性显著降低，减轻了脑缺血/再灌注损伤。

牡荆苷在脑缺血/再灌注损伤中具有很强的抗氧化应激能力，但脑缺血/再灌注损伤的发生机制复杂，各种因素间可能相互促进、相互影响，牡荆苷脑缺血/再灌注损伤保护作用机制需要进一步深入研究。

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[责任编辑：李蓟龙英文编辑：刘彦哲]

Anti-oxidative Stress of Vitexin on Brain in Mice with Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

YAN Juan1,ZHENG Mao-dong1,CUI Yu-huan2,ZHAO Xiu-hua1,BAN Xu-xia1,ZHAO Hong-xiu1

(1.Department of Pharmacy,The First Affiliated Hospital,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,Hebei China;2.Department of Geriatrics,The First Affiliated Hospital,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,Hebei China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of vitexin on the content of MDA and NO and the activities of SOD and NOS in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods70 Kunming male mice were randomly divided into the control group,sham-operation group,cerebral ischemia-reperfusion group,nimodipine group(0.6 mg·kg-1)and vitexin groups(10,20,40 mg·kg-1).Mice were prepared with cerebral ischemia-reperfusion injury by suture method,and then the contents of MDA and NO and the activities of SOD and NOS were determined by kit method.ResultsAfter reperfusion 24 h,neurological deficit score of cerebral ischemia-reperfusion group was significantly higher than that of the sham-operation group(P<0.01);whereas those of vitexin groups were significantly lower than the value of the model group(P<0.05).The contents of MDA and NO and the activity of NOS significantly increased(P<0.01),the activity of SOD significantly decreased(P<0.01)in cerebral ischemia-reperfusion group,vitexin groups significantly reduced the contents of MDA and NO and the activity of NOS(P<0.05),enhancing the activity of SOD(P<0.01).ConclusionThe protective effect of vitexin on cerebral ischemia-reperfusion injury might be produced by anti-oxidative stress.

Key words:vitexin;malondialdehyde;superoxide dismutase;nitric oxide;nitric oxide synthase;cerebral ischemia-reperfusion

基金项目：河北省卫生厅项目(No.20150474)

作者简介：颜娟(1984-)，女，博士，主管药师，研究方向，神经药理学。

中图分类号：R 285.5

文献标识码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-1492.2016.02.004

来稿日期：2015-07-14