王艳秋，武君颖, 李爱华

(1.沈阳市中医药学校中药教研室，辽宁 沈阳　110300； 2.沈阳飞龙制药有限公司质量管理部，辽宁 沈阳　110000)



高效液相色谱法测定齿叶白鹃梅叶中3种黄酮苷元的含量

王艳秋1*，武君颖1, 李爱华2

(1.沈阳市中医药学校中药教研室，辽宁 沈阳110300； 2.沈阳飞龙制药有限公司质量管理部，辽宁 沈阳110000)

摘要目的：建立齿叶白鹃梅叶中芹菜素、槲皮素和木犀草素3种黄酮苷元的含量测定方法。方法：采用酸水解法进行水解，对影响酸水解的主要因素酸浓度、水解温度和水解时间进行考察；采用高效液相色谱进行含量测定，色谱柱为Promosil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为乙腈-2%冰乙酸(V ∶V=20 ∶80)，柱温25 ℃，进样量10 μl，流速1.0 ml/min，检测波长267 nm。结果：酸水解条件为：盐酸-甲醇浓度为4.0 mol/L，水解温度为80 ℃，水解时间为5 h；含量测定中木犀草素、槲皮素和芹菜素的进样量分别在0.82～8.20、0.869 6～8.696 0和0.777 6～7.776 0 μg范围内具有良好的线性关系；平均加样回收率分别为95.8%、97.1%、99.6%。含量测定方法的精密度、稳定性、重复性也均符合有关规定。结论：本研究建立的水解方法和含量测定方法准确、可靠，可用于齿叶白鹃梅叶的质量控制。

关键词齿叶白鹃梅； 黄酮苷元； 含量测定

齿叶白鹃梅(ExochordaserratifoliaS. Moore.)，来源于蔷薇科绣线菊亚科白鹃梅属[1]，在辽宁凌源、喀左一带，民间多将其嫩叶作为野菜食用，用后有预防和治疗糖尿病的功效。研究者等对其进行化学成分的分离和结构鉴定[2-5]。药理研究结果也证明，齿叶白鹃梅叶确有降血糖和改善小鼠耐糖量的作用[6-8]。含量测定方面有总黄酮的含量以及黄酮单体含量的报道[9-11]。本研究采用酸水解法对齿叶白鹃梅叶中存在的黄酮苷进行水解，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)建立水解后的3种苷元，即芹菜素、木犀草素和槲皮素的含量测定方法，为更好地控制齿叶白鹃梅的质量奠定基础。

Agilent 1100 Series型高效液相色谱仪(包括真空脱气机、四元泵、柱温箱、VWD、HP1100化学工作站)(美国安捷伦科技有限公司)；CP225D型电子天平(Sartorius，十万分之一)。

1.2药品与试剂

齿叶白鹃梅叶采自辽宁省朝阳市凌源县，共3个批次，分别为样品1、样品2和样品3。经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为ExochordaserratifoliaS. Moore.；木犀草素、槲皮素、芹菜素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：20120206、 20120213、 20120314)；水为超纯水；甲醇、乙腈(天津科密欧试剂有限公司，色谱纯)，其他试剂均为分析纯。

色谱柱：Promosil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：乙腈-2%冰乙酸(V∶V=20 ∶80)；柱温25 ℃；进样量10 μl，流速1.0 ml/min；检测波长267 nm。

2.2对照品溶液的制备

精密称取木犀草素10.25 mg、槲皮素10.87 mg、芹菜素9.72 mg，甲醇定容至25 ml，摇匀，即得3种对照品溶液，浓度分别为0.410 0、0.434 8、0.388 8 mg/ml，即得。

2.3供试品溶液的制备

2.3.1水解时间的考察：取齿叶白鹃梅叶粉末1.0 g，共4份，精密称定，水解温度为80 ℃，盐酸浓度为5.0 mol/L，分别水解3、4、5、6 h，用HPLC检测，计算3种苷元的含量[12-14]。结果表明水解5 h和水解6 h时3种苷元的含量明显高于水解其他水解时间，而水解5 h和水解6 h时的含量差别不大，故水解时间确定为5 h。

2.3.2水解时酸浓度的考察：取齿叶白鹃梅叶粉末1.0 g，共四份，精密称定，水解温度80 ℃，水解时间为5 h，盐酸浓度分别为2.0、3.0、4.0、5.0 mol/L，用HPLC检测，计算3种苷元的含量[12-14]。结果表明盐酸浓度为4.0 mol/L水解效果最好。

2.3.3水解温度的考察：取齿叶白鹃梅叶粉末1.0 g，共4份，精密称定，盐酸浓度为4.0 mol/L，温度分别为60、70、80、90 ℃，水解5 h，用HPLC检测，计算3种苷元的含量[12-14]。结果表明水解温度为70 ℃水解效果最好。

综上所述，供试品溶液的制备方法为：精密称取齿叶白鹃梅叶粉末1.0 g，精密称定，加入4.0 mol/L盐酸-甲醇溶液50 ml，于80 ℃的水浴中反应5 h，冷却后过滤，用甲醇定容至50 ml，过0.45 μm滤膜，即得。水解液和对照品溶液的色谱图见图1。

图1　水解液(A)、木犀草素(B)、槲皮素(C)和芹菜素(D)HPLC图Fig 1　HPLC of hydrolysate(A), luteolin(B), quercetin (C) and apigenin(D)

2.4线性范围考察

取上述3种对照品溶液，分别进样2、4、6、8、10、20 μl，经HPLC检测后，分别以进样量为横坐标，吸收峰面积为纵坐标，得木犀草素的回归方程为：Y=17 010X+68.714，r=0.999 0，表明木犀草素在0.82～8.20 μg范围内具有良好的线性关系；槲皮素的回归方程为：Y=26 989X+199.10，r=0.999 1，表明槲皮素在0.869 6～8.696 0 μg范围内具有良好的线性关系；芹菜素的回归方程为：Y=31 876X+501.09，r=0.999 3，表明芹菜素在0.777 6～7.776 0 μg范围内具有良好的线性关系。

2.5精密度试验

取各对照品溶液，分别连续进样6次，以峰面积计算RSD值。结果，木犀草素、槲皮素、芹菜素的RSD值均<3.0%，符合有关规定。

2.6稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、16、24 h进样，测定木犀草素、槲皮素、芹菜素的峰面积，RSD值均<3.0%，符合有关规定。

2.7重复性试验

取同一批样品6份，每份1 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，进样，测定峰面积，计算木犀草素、槲皮素、芹菜素的含量，平均值分别为1.08%、0.91%和3.25%，RSD值均<3.0%，符合有关规定。

2.8加样回收率试验

精密称取已知含量的样品6份，分别精密加入3种对照品溶液，测定含量，并计算回收率。结果，木犀草素、槲皮素、芹菜素的平均加样回收率分别为95.8%、97.1%、99.6%，RSD值均<3.0%。

2.9样品测定结果

按上述方法测定3个批次齿叶白鹃梅叶中木犀草素、槲皮素和芹菜素的含量，每个样品平行2例，见表1。

表1　齿叶白鹃梅叶中3种黄酮苷元的含量测定结果(%)

本研究通过对齿叶白鹃梅叶酸水解条件进行考察，主要考察了对酸水解影响较大的酸浓度、水解温度和水解时间3个影响因素，以3种苷元的含量作为考察指标，最终确定了将齿叶白鹃梅叶中含有的黄酮苷水解为苷元的最佳工艺为齿叶白鹃梅叶粉末1.0 g，加入4.0 mol/L盐酸-甲醇溶液50 ml，于80 ℃的水浴中反应5 h。

本研究采用HPLC建立了齿叶白鹃梅水解叶中木犀草素、槲皮素和芹菜素这三种苷元的含量测定方法，确定色谱条件为C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为乙腈-2%冰乙酸(V∶V=20 ∶80)，柱温设置在25 ℃，检测波长设为267 nm。还对包括线性范围、精密度、稳定性、重复性和加样回收率在内的方法学进行了考察，最终建立的含量测定方法可用于齿叶白鹃梅叶的质量控制。

参考文献

[1]傅沛云.北植物检索表[M].2版.北京:科学出版社，1995:283-284.

[2]才谦,王聪,刘玉强.齿叶白鹃梅叶中黄酮类成分的分离与结构鉴定[J].沈阳药科大学学报,2011,28(3):190-192.

[3]王聪,刘玉强,才谦.齿叶白鹃梅叶化学成分研究[J].辽宁中医药大学学报，2011，13(5):245-246.

[4]祁晓旭,刘玉强,才谦.齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物HPLC指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志,2013，19(6):152-154.

[5]才谦,王灵芝,刘玉强,等.齿叶白娟梅叶化学成分研究[J].中草药,2012,43(4):673-675.

[6]王聪，刘玉强，才谦.齿叶白鹃梅叶对小鼠糖耐量的影响及降糖作用研究[J].中国实验方剂学,2011,17(2):283-284.

[7]王聪.齿叶白鹃梅叶的化学成分及药理作用研究[D].辽宁：辽宁中医药大学,2011.

[8]王灵芝.齿叶白鹃梅叶的化学成分及药理作用研究(Ⅱ)[D].辽宁：辽宁中医药大学,2012.

[9]祁晓旭.齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物药代动力学和质量控制研究[D].辽宁：辽宁中医药大学,2013.

[10]才谦,王聪,刘玉强.HPLC法同时测定齿叶白鹃梅叶子中芹菜素-7-O-β-D-新橙皮糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量[J].药物分析杂志，2011,17(2):283-284.

[11]王聪,刘玉强,才谦.齿叶白鹃梅不同部位总黄酮的含量测定[J].现代中药研究与实践，2011，25(5):66-68.

[12]李博,邓仕任,贾天柱,等.高效液相测定酸水解芫花黄酮苷元含量[J].化学工程师，2010,178(7):20-21,37.

[13]李古月,刘佳鑫,才谦.齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物酸水解工艺及水解后苷元含量测定[J].天津中医药,2014,31(5):306-309

[14]王志宏,周云雷,彭胜,等.HPLC法同时测定水解前后杜仲叶黄酮苷元的含量[J].应用化工,2014,43(5):950-954.

Content Determination of Three Flavonoid Aglycones in Leaves ofExochordaserratifoliaS. Moore. By HPLC

WANG Yanqiu1, WU Junying1, Li Aihua2

(1.Traditional Chinese medicine teaching and research section, Shenyang Traditional Chinese Medicine School Shenyang, Liaoning Shenyang 110300, China; 2.Dept.of Quality Control, Shenyang Green Pharmaceutical co. LTD, Liaoning Shenyang 110000, China)

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish the content determination method of apigenin, quercetin and luteolin in the leaves of Exochorda serratifolia S. Moore.. METHODS: Acid hydrolyzation was adopted, and the acid concentration, hydrolysis temperature, hydrolysis time were investigated and contents of the flavonoid aglycones were determined by HPLC. The Promosil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)column was adopted, the mobile phase was consisted of acetonitrile-2% glacial acetic acid(V ∶V=20 ∶80), the column temperature was 25 at sample size of 10 μl and flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength was set at 267 nm. RESULTS: The conditions of acid hydrolysis were: concentration of hydrochloric acid at 4.0 mol/L with temperature at 80℃, for 5 h. The calibration curves were linear in the range of 0.82-8.20, 0.869 6-8.696 0 μg and 0.777 6-7.776 0 μg. The average recovery rates were 95.8%，97.1% and 99.6%, respectively. The precision, stability and repeatability of content determination conform to the related regulations. CONCLUSIONS: This method is accurate and reliable and can be used for the quality control of leaves of Exochorda serratifolia S. Moore..

KEYWORDSExochorda serratifolia S. Moore; Flavonoid aglycones; Content determination

1材料

1.1仪器

2方法与结果

2.1色谱条件

3讨论

中图分类号R927.2

文献标志码A

文章编号1672-2124(2016)06-0796-03

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.06.028

(收稿日期：2016-01-06)

*高级讲师。研究方向：药物分析与质量研究及其相关教学。E-mail：980292565@qq.com

*副主任药师。研究方向：药品的质量控制和分析。E-mail:122502654@qq.com