文艳飞，　蔡柳洪△，　何　文，　曾敏慧，　蒋满波

(1中山大学附属第三医院生殖医学中心, 广东 广州 510630;2中山大学孙逸仙纪念医院生殖医学中心, 广东 广州 510120； 3广东省中医院生殖科，广东 广州 510006)

卵巢早衰患者来源的诱导多能干细胞的建系、鉴定及诱导分化*

文艳飞1，蔡柳洪1△，何文1，曾敏慧2，蒋满波3

(1中山大学附属第三医院生殖医学中心, 广东 广州 510630;2中山大学孙逸仙纪念医院生殖医学中心, 广东 广州 510120；3广东省中医院生殖科，广东 广州 510006)

[摘要]目的： 建立和鉴定卵巢早衰(又称原发性卵巢功能不全，primary ovarian insufficiency，POI)患者来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，研究其向原始生殖细胞分化的潜能。方法: 将表达Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4和Lin28基因的pEB-C5和表达SV40 T抗原的pEB-Tg质粒转染POI患者的外周血单个核细胞，将其重编程为iPSCs并检测其干细胞多能性特性。添加转化生长因子β1(transfroming growth factor-β1，TGF-β1)和骨形态发生蛋白 4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)后，应用real-time PCR和 Western blot方法分别检测原始生殖细胞标志物的mRNA及蛋白表达水平。结果: 通过碱性磷酸酶染色、细胞免疫荧光、拟胚体及畸胎瘤形成检测，证明了POI患者外周血来源的iPSCs可成功向3胚层细胞分化并保持多能性。添加TGF-β1和BMP4后，诱导组原始生殖细胞特异性标志物干细胞生长因子受体(stem cell growth factor receptor, c-Kit)、发育多能性相关蛋白 3 (developmental pluripotency-associated 3，STELLA/DPPA3)和DEAD盒多肽 4(DEAD box polypeptide 4，VASA/DDX4)的mRNA水平明显升高(P<0.05)，VASA/DDX4蛋白表达水平亦明显增加(P<0.05)。结论: POI患者外周血单个核细胞在体外可被成功诱导成无外源性基因整合的iPSCs，并且具有多能分化特性，添加TGF-β1和BMP4后可向原始生殖细胞分化。

[关键词]原发性卵巢功能不全； 诱导多能干细胞； 原始生殖细胞

卵巢早衰(premature ovarian failure;又称原发性卵巢功能不全, primary ovarian insufficiency，POI)是指育龄女性40岁以前出现卵巢功能减退，表现闭经、高促性腺激素和低雌激素状态[1]，是女性不孕的常见原因。其诊断标准为40岁之前出现原发或继发性闭经至少4个月、血清卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)水平至少2次大于40 IU/L(2次检查时间间隔至少1个月)和低雌激素水平[2]。……