杨四梅,　张佳瑶,　李　菲,　胡旭芳,　曹秋娥

(云南大学化学科学与工程学院, 教育部自然资源药物化学重点实验室, 云南 昆明 650091)



基于离子液体促进的手性配体交换毛细管电泳法分离分析去氧肾上腺素光学异构体

杨四梅,张佳瑶,李菲,胡旭芳,曹秋娥*

(云南大学化学科学与工程学院, 教育部自然资源药物化学重点实验室, 云南 昆明 650091)

摘要:基于非手性离子液体对手性配体交换的促进作用,建立了一种测定去氧肾上腺素手性异构体的毛细管电泳分离分析方法。在系统优化了电泳条件后,采用20 kV的分离电压、25 ℃的毛细管柱温、254 nm的检测波长以及5 s的压力(3 447 Pa)进样时间,在添加4.0 mmol/L Cu(Ⅱ)、8.0 mmol/L L-脯氨酸(L-Pro)和15 mmol/L氯化-1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]Cl)的20 mmol/L Tris-H3PO4缓冲溶液(pH 5.4)中,R-去氧肾上腺素和S-去氧肾上腺素的分离度为1.42,峰面积与质量浓度分别在12.5～150.0 mg/L和15.0～150.0 mg/L范围内有线性关系。将该方法用于加标血液和尿液样品中R和S型去氧肾上腺素的测定,尿液中的加标回收率为93.7%～108.2%,相对标准偏差在3.18%(n=3)以内；血液中的加标回收率为91.4%～113.1%,相对标准偏差在4.82%(n=3)以内。

关键词:毛细管电泳;手性配体交换;离子液体;去氧肾上腺素;光学异构体;手性分离

手性配体交换毛细管电泳始于Gassmann等[1]用Cu(Ⅱ)-L-组氨酸配合物为添加剂分离丹酰化氨基酸对映体,其分离识别机理一般认为是分析对象与金属手性配合物中的部分手性配体发生了配体交换作用并形成三元配合物,而具有不同构象的异构体分子形成的三元配合物的稳定性存在差异,从而得到分离。目前,手性配体交换毛细管电泳已成为分离手性化合物的重要电泳模式之一,并在氨基酸、羟基酸等对映体的分离分析中受到了人们的高度重视[2-7],但用其分离其他类型的药物对映体的研究报道较少。而且金属配合物体系容易吸附在毛细管内壁上,导致多数方法的重现性不够理想,难以用于定量测定。离子液体一般由有机阳离子和无机阴离子组成,其阳离子部分能在毛细管内壁发生吸附作用,这不仅可以改变毛细管内壁的电荷情况,改善分离,而且吸附在毛细管内壁上的离子液体与组分分子的相互作用也能对分离产生促进作用。因此,近年来将离子液体作为毛细管电泳的添加剂来改善分离尤其是改善环糊精对手性药物的分离得到了广泛关注[8-13]。

去氧肾上腺素为人工合成拟肾上腺素药,在临床上不仅常用于治疗感染中毒性及过敏性休克心搏骤停、支气管哮喘等,还可用于治疗感冒的复方制剂中,以缓解感冒引起的发热、头痛、鼻塞、全身酸痛等症状。去氧肾上腺素具有左旋(R构型)和右旋(S构型)两种光学异构体,其中R构型为光学活性体,S构型为无效异构体。因此控制产品中S构型的含量对于该药物的疗效至关重要。目前报道的分离分析去氧肾上腺素光学异构体的方法主要是手性色谱法[14],基本未见毛细管电泳法。本文采用手性配体交换毛细管电泳法,以离子液体为添加剂,对去氧肾上腺素手性对映体进行了分离分析。结果表明,将氯化-1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]Cl)添加到含有Cu(Ⅱ)与L-脯氨酸手性配合物的电解质溶液中后,原本重叠严重的去氧肾上腺素手性对映体的电泳峰实现了有效分离,这不仅证明了[BMIM]Cl对Cu(Ⅱ)与L-脯氨酸手性配合物体系电泳分离去氧肾上腺素手性对映体有促进作用,而且据此现象建立的分离分析去氧肾上腺素光学异构体的毛细管电泳法与文献报道的色谱法[14]相比,具有简单、快速,能准确定量的优点。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

P/ACETMMDQ型高效毛细管电泳仪带二极管阵列紫外检测器(美国Beckman Coulter公司),数据处理采用32Karat软件;未涂层石英毛细管(57 cm×75 μm,有效长度50 cm;河北省永年锐沣色谱器件有限公司)。

标准品R-去氧肾上腺素和去氧肾上腺素外消旋体盐酸盐购于美国Sigma公司;L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-组氨酸(L-His)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-色氨酸(L-Trp)、L-赖氨酸(L-Lys)、L-亮氨酸(L-Leu)购自上海华美生物工程公司;[BMIM]Cl购于上海迈瑞尔化学技术有限公司。

实验用试剂除特别说明外均为分析纯,水为高纯水。

1.2溶液配制

标准溶液:R-去氧肾上腺素和去氧肾上腺素外消旋体标准储备溶液均用水配制,4 ℃下保存;工作溶液由储备溶液用水稀释得到。

样品溶液:将取自健康人的尿样与血样(云南大学校医院)以及加标后的尿样与血样在2 000 r/min下离心10 min,上清液用0.45 μm滤膜过滤后直接进样分析。

1.3HPCE的条件与方法

运行电解质溶液为含有4.0 mmol/L Cu(Ⅱ)、8.0 mmol/L L-Pro、15.0 mmol/L [BMIM]Cl的20 mmol/L Tris-H3PO4缓冲溶液(pH 5.4),使用前用0.45 μm滤膜过滤;分离电压为20 kV,柱温为25 ℃,检测波长为254 nm,采用压力(3 447 Pa)进样5.0 s。为了确保重现性,毛细管柱每天在运行前和两次运行间依次用0.1 mmol/L NaOH溶液、水和运行电解质溶液各冲洗5 min。

2结果与讨论

基于去氧肾上腺素分子中的相邻位置上含有一个-OH基及一个N原子,具有与Cu(Ⅱ)配位的能力,而且其中的-OH基还处于手性C原子上,其与Cu(Ⅱ)配位的能力随光学结构的不同会有所不同,因此拟采用手性配体交换原理实现去氧肾上腺素外消旋体的分离。为此,实验首先在无其他添加剂的情况下,研究了以手性配体交换毛细管电泳中常用的几种氨基酸(L-Phe、L-His、L-Pro、L-Trp、L-Lys以及L-Leu)与Cu(Ⅱ)的配合物为手性选择剂,对去氧肾上腺素外消旋体进行分离。结果表明,在上述手性配合物存在下,虽经多方案优化电泳条件,去氧肾上腺素外消旋体都没有得到基本分离。考虑到离子液体在电泳中对分离尤其对环糊精分离手性药物的改善作用,实验尝试了在手性配体交换基础上,引入离子液体作为添加剂,利用离子液体对手性配体交换的促进作用,达到对去氧肾上腺素外消旋体分离的目的。

2.1配体种类、配合物组成比例及浓度的影响

选择了简单易得且溶解性好的咪唑类离子液体[BMIM]Cl为添加剂,在含有10 mmol/L [BMIM]Cl的20 mmol/L Tris-H3PO4缓冲溶液(pH 5.0)中添加3.0 mmol/L的Cu(Ⅱ)以及6.0 mmol/L氨基酸(L-Pro、L-Trp、L-Phe、L-His、L-Lys及L-Leu),研究了不同的手性配体对分离与检测的影响。结果表明,添加L-Lys和L-Leu与Cu(Ⅱ)的配合物对去氧肾上腺素外消旋体的分离基本没有作用,但添加其余4种手性氨基酸与Cu(Ⅱ)的配合物可以使去氧肾上腺素外消旋体得到一定程度的分离,其中以加入L-Pro与Cu(Ⅱ)的配合物得到的分离度最大,为1.02。因此,实验选择L-Pro与Cu(Ⅱ)的配合物作为分离去氧肾上腺素外消旋体的手性选择剂,并进一步研究了L-Pro与Cu(Ⅱ)的加入比例以及浓度对分离的影响。

固定电解质溶液中Cu(Ⅱ)的浓度为3.0 mmol/L,依次加入不同浓度的L-Pro,组成L-Pro与Cu(Ⅱ)的物质的量比依次为0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1及4∶1的配合物体系,考察了L-Pro与Cu(Ⅱ)的比例对去氧肾上腺素外消旋体分离的影响。图1a的结果表明,去氧肾上腺素外消旋体的分离度随L-Pro与Cu(Ⅱ)加入比例的增加先增大后减小,当加入的物质的量比为2∶1时,具有最大的分离度。

保持L-Pro与Cu(Ⅱ)的物质的量比为2∶1不变,在1.0～6.0 mol/L配合物浓度范围内,研究了配合物Cu(L-Pro)2的浓度对分离的影响。随着配合物浓度的增加,去氧肾上腺素外消旋体的分离度有所提高(见图1b),但组分的迁移时间有所延长,基线噪声增加,检测灵敏度下降。这是因为随着配合物浓度的增加,电解质溶液的离子强度以及背景吸收都会增加。综合考虑分离度、分析时间、检测灵敏度以及基线噪声,选择4.0 mmol/LCu(L-Pro)2为分离去氧肾上腺素外消旋体的手性选择剂。

图1　(a)L-脯氨酸(L-Pro)与Cu(Ⅱ)的物质的量比及 (b)Cu(L-Pro)2的浓度对去氧肾上腺素光学异构体分离度的影响Fig. 1　Effects of (a) the mole ratio of L-proline (L-Pro) to Cu(Ⅱ) and (b) concentration of Cu(L-Pro)2 on the resolution for the separation of the optical isomers of phenylephrine

2.2电解质溶液的pH以及缓冲溶液浓度的影响

在固定电解质溶液中Cu(L-Pro)2的浓度为4.0 mmol/L以及Tris浓度为20 mmol/L条件下,用H3PO4溶液在pH 3.5～8.0范围内调节电解质溶液的pH,试验了pH值对分离的影响。结果表明,随着电解质溶液pH的增加,去氧肾上腺素两个光学异构体的迁移时间均先缩短后增长,分离度则先增加后降低(见图2)。当pH为5.4时,去氧肾上腺素异构体的分离度具有最大值,而且迁移时间较短。这可能是因为随着电解质溶液pH的增加,一方面毛细管内壁带负电荷的程度增加,电渗流增加;另一方面去氧肾上腺素的酚羟基的电离能力也随之增强,迁移速度下降,因此去氧肾上腺素异构体的迁移时间随溶液pH的变化有最小值。此外,在电解质溶液的pH较低时,Cu(Ⅱ)与L-Pro之间难以形成稳定的配合物,因此对去氧肾上腺素异构体的分离能力较差;而当pH较高时,Cu(Ⅱ)与L-Pro形成的配合物可能过于稳定,从而难以被去氧肾上腺素异构体置换,因此分离度也不高。实验最终选择电解质溶液的pH值为5.4。

缓冲溶液的浓度对分离有一定的影响。在10～50 mmol/L范围内,随着缓冲溶液浓度的增加,组分的分离度变化不明显,但迁移时间和基线噪声特别是基线噪声有所增加。因此,实验选用20 mmol/L Tris-H3PO4(pH 5.4)为分离缓冲体系。

图2　电解质溶液的pH值对R-去氧肾上腺素和S-去氧肾上腺素迁移时间的影响Fig. 2　Effect of the pH value of electrolyte solution on the migration times of R-phenylephrine and S-phenylephrine

2.3[BMIM]Cl浓度的影响

图3是电解质溶液中离子液体[BMIM]Cl的浓度对去氧肾上腺素异构体迁移时间的影响。可见,在没有[BMIM]Cl存在时,两组分重叠严重,基本上没有得到分离。随着[BMIM]Cl的浓度在5～20 mmol/L范围内不断增加,两组分的迁移时间和分离度均增加。但当离子液体的浓度超过15 mmol/L以后,基线噪声明显增大,而且峰形有所展宽。这可能是因为随着[BMIM]Cl浓度的增加,不仅电解质溶液的离子强度增加,而且离子液体带正电荷的部分在毛细管内壁上的吸附量增加,因此电渗流降低,组分迁移时间延长,基线噪声增大。同时,随着离子液体浓度的增加,其与被分离物之间的相互作用增加,因此分离度增加。综合考虑,选择[BMIM]Cl的浓度为15 mmol/L。

图3　氯化-1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]Cl)浓度对R-去氧肾上腺素和S-去氧肾上腺素迁移时间的影响Fig. 3　Effect of the concentration of 1-butyl-3- methylimidazolium chloride ([BMIM]Cl) on the migration times of R-phenylephrine and S-phenylephrine

2.4电压、柱温和进样时间的影响

在上述选定的电解质溶液中,研究了分离电压、柱温和进样时间对去氧肾上腺素光学异构体分离的影响。结果表明,随着分离电压和毛细管柱温的增加,去氧肾上腺素两个光学异构体的迁移时间均不断缩短,分离度下降,而且当电压达到25 kV(柱温为25 ℃)或柱温达到30 ℃(电压为20 kV)以上时,基线噪声明显,容易出现断流现象。组分的检测灵敏度随着进样时间(进样压力为3 447 Pa)的增加而增大,但组分的峰形在进样时间大于5 s后逐渐展宽,分离度下降。实验选用了分离电压为20 kV,毛细管柱温为25 ℃,在3 447 Pa压力下进样5.0 s。

图4为在上述选定的电泳条件下得到的去氧肾上腺素外消旋体及加标血清样品的代表性电泳图。可见,在此条件下,去氧肾上腺素的两个光学异构体不管是在标准溶液还是血清样品中都得到了有效分离。

图4　(a)空白血样、(b)加标血样以及(c)去氧肾上腺素外消旋体标准溶液的电泳图Fig. 4　Electropherograms of (a) a blank blood sample, (b) the blood spiked with phenylephrine raceme and (c) the standard solution of phenylephrine raceme　Separation conditions: running buffer, 20 mmol/L Tris-H3PO4 buffer (pH 5.4) composed of 4.0 mmol/L Cu(Ⅱ), 8.0 mmol/L L-Pro and 15 mmol/L [BMIM]Cl; applied voltage, 20 kV; capillary temperature, 25 ℃; detection wavelength, 254 nm; injection, 5 s at 3 447 Pa.　Peaks: 1. R-phenylephrine; 2. S-phenylephrine.

2.5工作曲线和方法的精密度

在优化后的实验条件下,首先对一系列不同浓度的R-去氧肾上腺素标准溶液进行电泳分析,得到了R-去氧肾上腺素的工作曲线,然后用该工作曲线求得去氧肾上腺素外消旋体标准溶液中R-去氧肾上腺素的浓度,再用总浓度差减后求得外消旋体标准溶液中S-去氧肾上腺素的浓度,并由此得到了S-去氧肾上腺素的工作曲线。同时,实验还对100 mg/L的外消旋体标准溶液进行了5次平行测定,得到了两个光学异构体的峰面积A与迁移时间t的相对标准偏差(RSD)。表1的结果表明,方法具有较好的重现性和一定的实际应用价值。

表 1　方法的线性关系与精密度

A: peak area;C: mass concentration, mg/L.

2.6样品的测定结果及加标回收率

将处理后的空白及加标血液与尿液样品,用优化后的电泳条件进行了分离分析,结果见表2。可见,在空白血液与尿液中均没有检测到R-去氧肾上腺素与S-去氧肾上腺素,而R-去氧肾上腺素与S-去氧肾上腺素在尿液中的加标回收率为93.7%～108.2%,相对标准偏差在3.18%(n=3)以内,在血液中的加标回收率为91.4%～113.1%,相对标准偏差在4.82%(n=3)以内。

表 2　样品测定结果及加标回收率(n=3)

3结论

研究结果表明,离子液体氯化-1-丁基-3-甲基咪唑对Cu(Ⅱ)与L-脯氨酸手性配合物体系电泳分离去氧肾上腺素光学异构体具有促进作用。而且基于配体交换与离子液体协同作用建立的分离分析去氧肾上腺素光学异构体的毛细管电泳方法具有较好的分离度与较高的定量分析准确度,有一定的实际应用价值。

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Separation and determination of optical isomers of phenylephrine by chiral ligand exchange capillary electrophoresis coupling with the promoting effect of ionic liquid

YANG Simei, ZHANG Jiayao, LI Fei, HU Xufang, CAO Qiue*

(Key Laboratory of Medicinal Chemistry for Nature Resource, Ministry of Education, School of Chemical Science and Technology, Yunnan University, Kunming 650091, China)

Abstract:A method for the separation and determination of optical isomers of phenylephrine was developed based on the promoting effect of non-chiral ionic liquid on chiral ligand-exchange capillary electrophoresis after the electrophoretic parameters were optimized systematically. R-phenylephrine and S-phenylephrine can be separated and determined effectively in 20 mmol/L Tris-H3PO4 buffer solution (pH 5.4) composed of 4.0 mmol/L Cu(Ⅱ), 8.0 mmol/L L-proline (L-Pro) and 15 mmol/L 1-butyl-3-methylimidazolium chloride ([BMIM]Cl) with the applied voltage of 20 kV, capillary temperature of 25 ℃, detection wavelength of 254 nm, and injection of 5 s at 3 447 Pa. The resolution of R- and S-phenylephrines was 1.42. The linear ranges for the determination of R-phenylephrine and S-phenylephrine were 12.5-150 mg/L and 15.0-150 mg/L, respectively. The method has been satisfactorily used for the determination of R-phenylephrine and S-phenylephrine in the spiked blood and urine samples. The spiked recoveries in the urine sample were in the range of 93.7%-108.2% with the RSDs lower than 3.18%(n=3), and the spiked recoveries in the blood sample were in the range of 91.4% and 113.1% with the RSDs lower than 4.82%(n=3).

Key words:capillary electrophoresis; chiral ligand exchange; ionic liquid; phenylephrine; optical isomers; chiral separation

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.10013

*收稿日期:2015-10-12

基金项目:国家自然科学基金项目(21465025).

中图分类号:O658

文献标识码:A

文章编号:1000-8713(2016)01-0103-05

色谱手性分离专刊·研究论文

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Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21465025).