秦　静，张　坚，张纯涛，魏常虹，李裕钦，段大鹏

(1. 陕西省人民医院，陕西 西安 710068；2. 西安医学院第二附属医院，陕西 西安 710038)



黄芩苷对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞增殖、凋亡及侵袭性的影响

秦静1，张坚1，张纯涛2，魏常虹1，李裕钦1，段大鹏1

(1. 陕西省人民医院，陕西 西安 710068；2. 西安医学院第二附属医院，陕西 西安 710038)

[摘要]目的观察黄芩苷对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞增殖活性、凋亡指数、侵袭性及PCNA、CAS-3蛋白表达水平的影响，并探讨其可能机制。方法将对数生长期HXO-RB44细胞制成单细胞悬液接种于96孔培养板中，分为对照组及50，100，200 μg/mL黄芩苷组并给予相应剂量药物处理，MTT法测各组细胞增殖抑制率，流式细胞术测细胞凋亡指数，Transwell侵袭小室实验测细胞侵袭能力，Western Blot法检测PCNA、CAS-3蛋白表达情况。结果MTT结果显示黄芩苷对HXO-RB44细胞增殖有明显抑制作用，且呈时间依赖性；流式细胞术结果显示黄芩苷各组中HXO-RB44细胞凋亡指数显著高于对照组；Transwell侵袭小室实验显示黄芩苷能明显降低HXO-RB44细胞的侵袭能力，均呈剂量依赖性；Western blot显示随着黄芩苷浓度的增加，PCNA蛋白表达逐渐下降，而CAS-3蛋白表达增加，呈剂量依赖性。结论黄芩苷可抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，并抑制其侵袭能力，其可能是通过调控PCNA、CAS-3蛋白的表达，激活相关细胞凋亡信号通路来完成的。

[关键词]视网膜母细胞瘤；黄芩苷；增殖；侵袭

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是原发于视网膜的一种眼内恶性肿瘤，严重危害患者的视力和生命[1]。其治疗手段虽然有多种，但是大多数预后不佳，给患者的生存质量造成了严重影响[2-3]。现代药理研究表明，黄芩苷在清除氧自由基、调节免疫、促进细胞凋亡以及抗肿瘤等多方面均有作用[4]。本实验采用不同浓度(50，100，200 μg/ mL)黄芩苷作用于视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞，检测细胞增殖活性、凋亡指数、侵袭性以及PCNA、CAS-3蛋白的表达水平，从而探讨其对视网膜母细胞瘤的影响及其可能机制，为临床治疗提供理论基础。

1实验资料

1.1细胞来源及主要实验试剂人视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；胎牛血清、青链霉素购自美国Gibco公司；MTT、二甲基亚砜及所有抗体(CAS-3、PCNA)购自美国Sigma公司；细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司。

1.2实验方法

1.2.1视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞培养液氮中取出冻存的HXO-RB44细胞，放入37 ℃水浴箱中使之迅速融化。在超净工作台内吸出细胞悬液，注入含5 mL培养液的离心管中，低速离心3 min后弃上清，培养液吹打后移至细胞培养瓶，加入含10%～15%胎牛血清、100 μg/mL青链霉素的DMEM培养液中，置于37 ℃培养箱培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况，当细胞生长贴壁融合度为80%～90%时进行传代培养。

1.2.2MTT法检测HXO-RB44细胞增殖抑制率将对数生长期HXO-RB44细胞制成单细胞悬液，计数后接种于96孔培养板中，分为对照组及50，100，200 μg/mL黄芩苷组，对照组不加药物，其余按组别加入不同浓度黄芩苷，孵育24 h后每孔加入20 μL MTT，培养4 h去上清，每孔加入150 μL DMSO，终止反应。将96孔板移入平板振荡器，水平震荡10 min。酶联免疫检测仪于490 nm波长处测定每孔吸光度(OD)值，以空白对照孔的OD值调零，并记录结果。结果以每组4孔的均数±标准差表示，增殖抑制率=(l-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡率采用 Annexin V/PI双染色法，取对数生长期的HXO-RB44细胞，0.25%胰酶消化后制成细胞悬液，以1×105mL-1细胞密度接种于细胞培养板中，对照组不加药物，其余按组别加入不同浓度黄芩苷，用4 ℃预冷的PBS洗细胞2次，胰酶消化后，1 500 r/min离心5 min后弃上清，收集细胞，用PBS重新悬浮细胞，调节细胞浓度，取100 μL细胞悬液(约1×105个细胞)，1 500 r/min离心5 min后弃上清，加入500 μL的1×Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC，再加入10 μL PI，轻轻混匀，室温下避光反应5～10 min，上流式细胞仪分析。

1.2.4Transwell侵袭小室实验测细胞侵袭力将Matrigel胶铺于培养小室滤膜上，每孔20～30 μL, 37 ℃过夜凝胶，在膜的另一面涂上纤维黏连蛋白，约5×105细胞/mL 200 μL加入小室内，培养24 h后擦去膜上层细胞，将膜取下，甲醛室温固定30 min，苏木素染色，乙醇逐级脱水，二甲醛透明后，用刀片裁下膜，置于载玻片上，镜下计数(平均计数 4个视野)。

1.2.5Western blot检测HXO-RB44细胞PCNA、CAS-3蛋白表达情况培养的HXO-RB44细胞同步化后，对照组不加药物，其余按组别加入不同浓度黄芩苷，提取HXO-RB44细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度。按《分子克隆实验指南》所述方法进行SDS-PAGE电泳，电泳至溴酚蓝抵达分离胶底部结束电泳，取下凝胶并做标记，入电转缓冲液平衡5 min后转膜。纤维素膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。然后抗原抗体反应，并用辣根过氧化物酶化学增强剂显色反应。蛋白的表达水平根据GAPDH进行标化，通过软件进行灰度扫描、定量。

2结果

2.1各组HXO-RB44细胞增殖抑制率MTT法测定结果显示，黄芩苷对HXO-RB44细胞的增殖有明显抑制作用。在72 h时，对照组和50，100，200 μg/mL黄芩苷组HXO-RB44细胞增殖抑制率分别为(20.98±1.69)%，(32.68±1.21)%，(41.05±2.33)%，(57.54±3.66)%，各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)；各组HXO-RB44细胞增殖抑制率均随时间延长而逐渐增高。见图1。

图1　MTT法测定各组HXO-RB44细胞增殖抑制率

2.2各组HXO-RB44细胞凋亡率Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测结果发现，对照组和50，100，200 μg/mL黄芩苷组HXO-RB44细胞凋亡率分别为10.45%，22.19%，36.74%和54.89%，各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图2。

2.3各组HXO-RB44细胞侵袭性transwell侵袭小室实验测定结果发现，对照组和50，100，200 μg/mL黄芩苷组穿膜细胞数分别为357.86±36.12，269.48±29.35，187.84±23.57，121.59±16.43。各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.4各组HXO-RB44细胞PCNA、CAS-3蛋白表达情况Westtern blot分析测量各蛋白的表达水平，结果显示随着黄芩苷浓度的增加，PCNA蛋白的表达水平逐渐下降，而CAS-3蛋白的表达水平逐渐升高，经检验差异有统计学意义(P均<0.05)。见图3。

3讨论

视网膜母细胞瘤最早是由荷兰医生Pawius于1597年首次报道，在全世界发病率约为1∶20 000[5]，其发病率有逐年上升的趋势[6]。目前趋向于个性化综合治疗，其中包括化学减容法、外照射放疗、激光光凝、巩膜敷贴放疗、温热疗法、冷冻疗法、眼球摘除、眼眶内容剜除和针对转移肿瘤的全身化疗以及多种方法联合治疗[7-8]。随着各种治疗方法的进步以及早期诊断和及时治疗的实现，患者生存率得到了极大提高，但在发展中国家和不发达国家，生存率仍低于50%[9-10]。

图2　各组HXO-RB44细胞凋亡率

图3　各组HXO-RB44细胞PCNA、CAS-3蛋白表达水平

黄芩始载于《神农本草经》，归草部山草类，为唇形科多年生植物黄芩的干燥根。传统中医认为黄芩苷具有清热燥湿、泻火解毒等功效，并被用于肝癌、肺癌以及直肠癌等的治疗。现代药理研究表明，黄芩的作用主要包括抗肿瘤、抗病毒、消热镇痛等[11-12]。随着国际上对黄芩苷研究的逐步深入,发现黄芩苷可清除氧自由基，减轻组织的缺血再灌注损伤，调节免疫，促进细胞凋亡以及抗肿瘤和HIV。

本实验中MTT检测结果显示，黄芩苷对HXO-RB44细胞增殖具有明显抑制作用，这种抑制作用表现出良好的时间和剂量依赖性。利用流式细胞仪对细胞凋亡率的分析发现，与对照组相比，经黄芩苷作用后细胞凋亡率逐渐升高。transwell侵袭小室实验结果发现，黄芩苷各组穿膜细胞数明显减少。表明黄芩苷可抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，并抑制细胞的侵袭转移。

肿瘤的发生是多途径、多步骤的，细胞增殖与凋亡之间的平衡失调与肿瘤的发生发展密切相关[13]。PCNA是DNA复制所必需的，并已被证明是肿瘤增殖的一个重要标记，Survivin的表达已被证实与恶性肿瘤中PCNA和CAS-3表达相关联[14-15]。Caspase家族是细胞凋亡的执行者，决定了细胞凋亡的形态和生物化学改变[16]。本研究发现，不同浓度黄芩苷处理细胞后，可下调PCNA蛋白的表达，上调CAS-3蛋白的表达，且呈剂量依赖性，提示黄芩苷可能通过调节PCNA和CAS-3蛋白的表达参与视网膜母细胞瘤的增殖和凋亡。

综上所述，黄芩苷可抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制细胞侵袭、转移，可能是通过调节PCNA与CAS-3蛋白的表达，从而激活相关细胞凋亡信号通路来完成的，这可能为视网膜母细胞瘤提供一个潜在的治疗策略。

[参考文献]

[1]Kim JH,Kim JH,Yu YS,et al. Anti-tumor activity of arginine deiminase via arginine deprivation in retinoblastoma[J]. Oncol Rep，2007，18(6):1373-1377

[2]Shields CL,Meadows AT,Leahey AM,et al. Continuing challen-ges in the management of retinoblastoma with chemotherapy[J]. Retina,2004,24(6):849-862

[3]Beck MN,Balmer A,Dessing C,et al. First-line chemotherapy with local treatment can prevent external-beam irradiation and enucleation in low-stage intraocular retinoblastoma[J]. J Clin Oncol,2006,18(15):2881-2887

[4]张喜平，田华，程琪辉. 黄芩苷的药理作用研究现状[J]. 中国药理学通报，2003，19(11):1212-1215

[5]Gallie BL,Zhao J,Vandezande K,et al. Global issues and opportunities for optimized retinoblastoma care[J]. Pediatr Blood Cancer, 2007,49(7 Suppl):1083-1090

[6]Schiavetti A,Hadjistilianou T,Clerieo A,et al. Conservative therapy in intraocular retinoblastoma :response/recurrence rate[J]. J Pediatr Hematol Oncol,2005,27(1):3-6

[7]Shields CL,Meadows AT,Leahey AM,et al. Continuing challenges in the management of retinoblastoma with chemotherapy[J]. Retina,2004,24(6):849-862

[8]Beck MN,Balmer A,Dessing C,et al. First-line chemotherapy with local treatment can prevent external-beam irradiation and enucleation in low-stage intraocular retinoblastoma[J]. J Clin Oncol,2006,18(15):2881-2887

[9]Suzuki S,Kaneko A. Management of intraocular retinoblastoma and ocular Prognosis[J]. Int J Clin Oneol,2004,9(1):1-6

[10] Yanagisawa T. Systemic chemotherapy as a new conservative treatment for intraocular retinoblastoma[J]. Int J Clin Oncol,2004,9(1):13-24

[11] Miocinovic R,Mc-Cabe NP,Keck RW,et al. In vivo and in vitro effect of baicalein on human prostate cancer cells[J]. Int J Oncol,2005,26(1):241-246

[12]FranekKJ,ZhouZ,ZhangWD,etal.InvitrostudiesofbaicalinaloneorincombinationwithSalviamiltiorrhizaextractasapotentialanti-canceragent[J].IntJOncol,2005,6(1):217-224

[13] Wolrf B，Green DR. Suicidal Tendencies:Apoptotic cell death by caspase family proteinase[J]. J Bion Chem,1999,274(29):200-249

[14] Wang W,Luo H,Wang A. Expression of survivin and correlation with PCNA in osteosarcoma[J]. J Surg Oncol,2006,93(7):578-584

[15] Zou J,Gan M,Mao N,et al. Sensitization of osteosarcoma cell line SaOS-2 to chemotherapy by downregulating survivin[J]. Arch Med Res,2010,41(3):162-169

[16] Evan GI,Vousden KH. Proliferation,cell cycle and apoptosis in cancer[J]. Nature,2001,411(6835):342-348

Effects of baicalin on tumor proliferation, apoptosis and invasive capacity of retinoblastoma HXO-RB44 cell

QIN Jing1, ZHANG Jian1, ZHANG Chuntao2, WEI Changhong1, LI Yuqin1, DUAN Dapeng1

(1. Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi’an 710068, Shaanxi, China; 2. The Second Affiliated Hospital of Xi’an Medical College, Xi’an 710038, Shaanxi, China)

Abstract:Objective It is to observe the effect of baicalin on tumor proliferation activity, apoptosis index, invasive capacity and PCNA, CAS-3 proteins expression of retinoblastoma HXO-RB44 cell, and explore the molecular mechanisms. Methods The logarithmic growth phase HXO-RB44 cell were made into single cell suspension and inoculated in 96 well plates, and were divided into baicalin 50, 100, 200 μg/mL group and control group, and then the cells were treated with different concentrations of baicalin and equal volume of normal saline. MTT assay was used to detect cell proliferation inhibition rate, and flow cytometry was used to detect apoptosis index, and Transwell invasion assay was used to detect cell invasive capacity, and Western blot assay was used to determine the protein expression levels of PCNA and CAS-3. Results The MTT assay found that baicalin had significantly reduced the proliferative activities of HXO-RB44 cells in a time-dependent manner; the flow cytometric analysis results showed that the apoptosis index of HXO-RB44 cells in baicalin treated groups was markedly higher than that in the control group; Transwell invasion assay showed that the cell invasive capacity in baicalin treated groups was markedly lower than that in the control group; Western blot assays performed that the protein expression level of PCNA was gradually decreased, while CAS-3 expression was gradually increased with the increase of baicalin concentration in baicalin treated group. Conclusion Baicalin can inhibit the proliferation of HXO-RB44 cells, induced its apoptosis, and inhibit the invasion ability. The molecular mechanisms may through regulate the expression of PCNA and CAS-3, and active the apoptosis related signaling pathway.

Key words:retinoblastoma; baicalin; proliferation; invasive capacity

[作者简介]秦静，女，硕士，研究方向为眼底疾病。[通信作者]段大鹏，E-mail:15829086908@163.com

[基金项目]陕西省中医管理局课题 (13-JC029)；西安市科技计划项目(SF1315(4))

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.03.004

[中图分类号]R-33

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)03-0239-04

[收稿日期]2015-06-17