刘海艳　奚伟星　洪瑛　柴瑞

[摘要] 目的 初步探讨人CCR9基因对SW480结肠癌细胞侵袭功能的影响。 方法 取人外周血单个核细胞提取总RNA逆转录为cDNA，扩增提取CCR9的CDS序列，连接pLVX-puro质粒，Lipo2000感染人SW480结肠癌细胞，嘌呤霉素筛选并建立稳定转染细胞株。免疫印迹证实CCR9基因在SW480结肠癌细胞高效表达。 Transwell方法检测SW480结肠癌细胞侵袭。 结果 免疫印迹证实成功构建pLVX-puro-CCR9质粒，相比SW480细胞组，CCR9过表达SW480结肠癌细胞中CCR9显著表达[（26.0±10.7） vs （10.0±4.5），n=8，P=0.0078]，且在体外能够促进SW480结肠癌细胞侵袭（P=0.0136）。 结论 成功构建CCR9稳定表达结肠癌细胞株，并能够在体外显著促进其侵袭功能。

[关键词] 趋化因子受体；CCR9；分子克隆；侵袭；SW480结肠癌细胞

[中图分类号] R735.35 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）25-0001-03

Influence of over-expressed CCR9 on invasion of SW480 colon cancer cells

LIU Haiyan1 XI Weixing1 HONG Ying1 CHAI Rui2

1.Department of Clinical Laboratory， Zhejiang Provincial Tongde Hospital， Hangzhou 310012， China； 2.Department of Anorectal Surgery， Zhejiang Provincial Peoples Hospital， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To primarily explore the influence of human CCR9 gene on invasion function of SW480 colon cancer cells. Methods PBMC total RNA was extracted and reversely transcribed as cDNA， then amplified to extract CDS sequence of CCR9， which was then connected to pLVX-puro plasmid and Lipo2000 to infect human SW480 colon cancer cells， and screened by puromycin to establish stable transfection cell line. The over-expression of CCR9 gene in SW480 colon cancer cells was confirmed by western blotting. Transwell was used to detect invasion of colon cancer cells. Results PLVX-puro-CCR9 plasmids were successfully established as confirmed by western blotting. Compared with the SW480 cell group， CCR9 was significantly expressed in the CCR9 over-expression SW480 colon cancer cells [（26.0±10.7） vs （10.0±4.5）， n=8， P=0.0078]， and could facilitate invasion of SW480 colon cancer cells in vitro（P=0.0136）. Conclusion Colon cancer cell line with stable-expressed CCR9 can be successfully established， which can significantly facilitate the invasion function in vitro.

[Key words] Chemokine receptor； CCR9； Molecular clone； Invasion； SW480 colon cancer cell

趋化因子受体是一类介导趋化因子执行生物学功能的GTP蛋白耦联的跨膜受体，常表达于免疫细胞及内皮细胞等细胞膜上。它由细胞外N端、3个细胞外环和C端三个部分组成。趋化因子与细胞表面的受体特异性结合后可参与多种生理和病理过程，如细胞生长、分化、组织损伤以及恶性肿瘤的生长和转移等[1，2]。自从2002年以来已有大量文献表明趋化因子受体与结肠癌的转移有相关性，其中研究最为广泛的是CXCR4趋化因子受体，其能够显著促进结肠癌的远端转移[3]。近期文献表明CCR9在肿瘤的发生发展中具有重要作用，在肺癌的淋巴转移、前列腺癌的远端转移及肝癌和乳腺癌细胞株的恶性生物学功能中具有促进作用[3]，但在结肠癌方面，是否能促进结肠癌细胞侵袭的恶性生物学功能还未见相关研究。本研究拟构建过表达CCR9基因的结肠癌SW480细胞，并通过抗生素筛选在SW480细胞中的稳定表达，并采用Transwell实验验证其对结肠癌细胞侵袭的生物学功能影响。

1材料与方法

1.1 结肠癌细胞和质粒菌株

人SW480细胞购于武汉细胞库，DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司。DH5α菌株大肠杆菌购自杭州优宁维生物有限公司，pLVX-puro慢病毒载体购自美国Clontech公司。

1.2 试剂

BamH I和 EcoR I限制性内切酶（货号：1605和1040A，日本Takara公司）；质粒抽提试剂盒（货号：B518191，上海生工公司）；胎牛血清（货号：SH300700，美国Hyclone公司）；T4连接酶（货号：2011A，日本Takara公司）；人CCR9一抗（货号：ab32556，美国Abcam公司）；有基质胶的Transwell（货号：356234，美国Corning公司）；人淋巴细胞分离液（货号：DKW-KLSH-0100，深圳达科为生物公司）。

1.3 方法

1.3.1 SW480人结肠癌细胞的培养 SW480结肠癌细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基中，在37℃、5% CO2孵育箱贴壁培养，每隔3 d传代1次。

1.3.2 构建pLVX-puro-CCR9融合质粒 （1）CCR9的CDS序列获取 取健康人外周血5 mL，人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMC），在Pubmed公共数据库中获得CCR9的CDS编码区序列https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_031200.2，在克隆引物前后分别加入BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，用pfu聚合酶扩增CCR9的全长CDS序列，引物由上海生工公司合成。（2）pLVX-puro-CCR9-SW480稳定细胞株的建立 取健康人外周血PBMC的cDNA进行PCR扩增，PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。将pLVX-puro质粒和PCR电泳回收产物分别双酶切并电泳回收，用T4连接酶连接，将质粒进行DH5α大肠杆菌转化，细菌固体培养基培养并用质粒提取试剂盒进行质粒提取。将1×105 SW480结肠癌细胞接种于12孔板中，4 μg pLVX-puro-CCR9质粒或10 μL Lipo脂质体分别用250 μL无血清DMEM高糖培养基液稀释并孵育30 min，吸出培养液，加入新鲜不含胎牛血清的DMEM高糖培养基继续孵育6 h。6 h后吸去培养液加入DMEM高糖完全培养基，72 h后用含有0.25 μg/mL嘌呤霉素的DMEM高糖完全培养基筛选瞬时转染细胞株，再挑取单克隆转染SW480细胞继续培养。再用0.10 μg/mL嘌呤霉素维持筛选，继续培养。

1.3.3 免疫印迹检测CCR9蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，测量浓度后加含溴酚蓝的上样缓冲液，100℃变性3 min后进行免疫印迹。脱脂奶粉封闭0.5 h，再分别用β-actin及CCR9一抗室温孵育2 h。PBS缓冲液清洗5次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗并室温孵育1 h，PBS清洗5次后进行显影并记录数据。

1.3.4 过表达CCR9对结肠癌SW480细胞侵袭的影响 将0.5×105/mL的SW480和pLVX-puro-CCR9-SW480细胞加至Transwell上室中。下室加DMEM高糖完全培养基。培养36 h后取出小室后甲醇固定5 min，结晶紫染色20 min，最后用双蒸水清洗并记录结果。

1.4 统计学处理

采用SPSS10.0统计学软件进行统计分析，采用曼-惠特尼U检验分析SW480和CCR9-SW480细胞之间蛋白表达水平及侵袭之间的差异，数据以均数±标准差（x±s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后CCR9的SW480结肠癌细胞CCR9蛋白表达

免疫印迹结果显示β-actin和CCR9在42 kD和45 kD有特异性黑色条带。CCR9-SW480细胞组较SW480组颜色显著加深（图1A），统计学结果显示CCR9-SW480细胞中CCR9的蛋白表达量（灰度值：26.0±10.7，n=8）较SW480组（灰度值：10.0±4.5，n=8）显著升高（P=0.0078）。

2.2 CCR9对结肠癌SW480细胞体外侵袭能力的影响

Transwell结果显示CCR9显著促进SW480细胞体外侵袭能力（图2A、B），SW480或CCR9-SW480细胞每组随机抽取8个视野计数并统计，结果显示CCR9体外能够显著增强SW480结肠癌细胞的侵袭能力（P=0.0136）。

3 讨论

结肠癌作为全世界常见恶性肿瘤之一，每年有新发病例近120万人，已成为全球第四致死性恶性肿瘤，其中结肠癌的复发及转移是其主要原因。结肠癌伴有远端转移的患者长期生存率至今无法令人满意。结肠癌的远处转移部位主要是肝脏，约50%患者术前或术后会发生肝脏转移。其中30%患者在手术前已有影像学检测到阴匿性肝转移。但只有15%的患者适合手术切除，其中70%的患者术后复发[4]。因此探讨结肠癌细胞过度侵袭和远端转移具有重要的临床意义。

趋化因子受体是一类介导趋化因子行使功能的GTP蛋白耦联的跨膜受体，通常表达于免疫细胞、内皮细胞等细胞膜上。2001年Muller A首次提出了肿瘤细胞可以利用趋化因子及其受体的特异性结合实现器官特异性转移。目前，已有大量文献表明趋化因子受体在肿瘤转移中具有重要作用，但关于CCR9研究较少，少量文献报道CCR9及其配体CCL25相互作用，在肺癌的淋巴转移、前列腺癌的远端转移及肝癌和乳腺癌细胞株的恶性生物学功能中具有促进作用[5-8]，且CCR9的拮抗剂在白血病移植瘤小鼠模型中发挥治疗作用[7，8]。但CCR9在结肠癌细胞的侵袭和转移中是否具有重要作用[9-11]及其在结肠癌的肿瘤微环境中扮演怎样的角色还未明确，是否通过增加结肠癌细胞的恶性增殖，还是通过其侵袭或者转移功能来增加结肠癌细胞的生物学功能，还需要大量的研究去证实并阐明这些设想[12-16]，以便像其他趋化因子受体，为后期设计拮抗CCR9的小分子药物做生物学功能的铺垫[17-20]。

在本研究中，首先成功构建并建立稳定表达CCR9的结肠癌细胞，通过免疫印迹证实CCR9能够在SW480结肠癌细胞中稳定表达，并通过铺有基质胶的Transwell实验对CCR9在结肠癌细胞中的生物学功能进行初步研究，发现CCR9可以促进SW480结肠癌细胞的侵袭，很有可能在结肠癌细胞的远端转移的生物学功能扮演重要角色，从而，为下一步体外和体内肿瘤细胞转移等生物学功能研究作了实验铺垫。

[参考文献]

[1] Li B，Wang Z，Zhong Y，et al. CCR9-CCL25 interaction suppresses apoptosis of lung cancer cells by activating the PI3K/Akt pathway[J]. Med Oncol，2015，32（3）：66.

[2] Tu Z，Xiao R，Xiong J，et al. CCR9 in cancer：Oncogenic role and therapeutic targeting[J]. J Hematol Oncol，2016， 9：10.

[3] Zhang Z，Sun T，Chen Y，et al. CCL25/CCR9 signal promotes migration and invasion in hepatocellular and breast cancer cell lines[J]. DNA Cell Biol，2016，35（7）：348-357.

[4] Winawer SJ. The history of colorectal cancer screening：A personal perspective[J]. Dig Dis Sci，2015，60（3）：596-608.

[5] Krishnamoorthy V，Carr T，De Pooter RF，et al. Repression of Ccr9 transcription in mouse T lymphocyte progenitors by the Notch signaling pathway[J]. J Immunol，2015，194（7）：3191-3200.

[6] Lee S，Heinrich EL，Li L，et al. CCR9-mediated signaling through beta-catenin and identification of a novel CCR9 antagonist[J]. Mol Oncol，2015，9（8）：1599-1611.

[7] Chamorro S，Vela M，Franco-Villanueva A，et al. Antitumor effects of a monoclonal antibody to human CCR9 in leukemia cell xenografts[J]. MAbs，2014，6（4）：1000-1012.

[8] Wu W，Doan N，Said J，et al. Strong expression of chemokine receptor CCR9 in diffuse large B-cell lymphoma and follicular lymphoma strongly correlates with gastrointestinal involvement[J]. Hum Pathol，2014，45（7）：1451-1458.

[9] Heinrich EL，Arrington AK，Ko ME，et al. Paracrine activation of chemokine receptor CCR9 enhances the invasiveness of pancreatic cancer cells[J]. Cancer Microenviron，2013，6（3）：241-245.

[10] Zhang Z，Qin C，Wu Y，et al. CCR9 as a prognostic marker and therapeutic target in hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep，2014，31（4）：1629-1636.

[11] Ye LF，Huang J，Zhang LP，et al. Intracellular expression profile and clinical significance of the CCR9-CCL25 chemokine receptor complex in nasopharyngeal carcinoma[J]. J Laryngol Otol，2015，129（10）：1013-1019.

[12] Song Lee Y，Kim SY，Song SJ，et al. Crosstalk between CCL7 and CCR3 promotes metastasis of colon cancer cells via ERK-JNK signaling pathways[J]. Oncotarget，2016，10：9209.

[13] Salerno EP，Olson WC，Mcskimming C，et al. T cells in the human metastatic melanoma microenvironment express site-specific homing receptors and retention integrins[J]. Int J Cancer，2014，134（3）：563-574.

[14] Vela M，Aris M，Llorente M，et al. Chemokine receptor-specific antibodies in cancer immunotherapy：Achievements and challenges[J]. Front Immunol，2015，6：12.

[15] Zhong Y，Jiang L，Lin H，et al. Expression of CC chemokine receptor 9 predicts poor prognosis in patients with lung adenocarcinoma[J]. Diagn Pathol，2015，10：101.

[16] Pal J，Patil V，Mondal B，et al. Epigenetically silenced GNG4 inhibits SDF1alpha/CXCR4 signaling in mesenchymal glioblastoma[J]. Genes Cancer，2016，7（3-4）：136-147.

[17] Rosero RA，Villares GJ，Bar-Eli M. Protease-activated receptors and other G-protein-coupled receptors：The melanoma connection[J]. Front Genet，2016，7：112.

[18] Pozzobon T，Goldoni G，Viola A，et al. CXCR4 signaling in health and disease[J]. Immunol Lett，2016，177：6-15.

[19] Skovdahl HK，Granlund A，Ostvik AE，et al. Expression of CCL20 and its corresponding receptor CCR6 is enhanced in active inflammatory bowel disease，and TLR3 mediates CCL20 expression in colonic epithelial cells[J].PLoS One，2015，10（11）：e0141710.

[20] Wang H，Tao L，Qi KE，et al. CXCR7 functions in colon cancer cell survival and migration[J]. Exp Ther Med，2015， 10（5）：1720-1724.

（收稿日期：2016-05-20）