李 强, 闫静静， 卓其斌, 章树业, 陈 良

复旦大学附属公共卫生临床中心 1.肝炎一科; 2.科学研究部，上海 201508

SLC10A1 基因p．S267F 位点单核苷酸多态性对慢性乙型肝炎患者肝功能的影响

李 强1, 闫静静2， 卓其斌1, 章树业2, 陈 良1

复旦大学附属公共卫生临床中心 1.肝炎一科; 2.科学研究部，上海 201508

目的 探讨SLC10A1基因p.S267F位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)对慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者肝功能的影响。方法 纳入初治CHB患者153例，其中p.S267F位点野生型(C/C)132例，突变型(C/T)21例。T检验比较p.S267F位点野生型与突变型CHB患者各项肝功能指标间的差异。结果 SLC10A1基因p.S267F位点突变型CHB患者的ALT、AST、TBIL和DBIL水平均显著低于野生型患者(P<0.05)；两组患者ALP、GGT和TBA水平间的差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 SLC10A1基因p.S267F位点突变型CHB患者的肝功能损伤程度低于野生型CHB患者，SLC10A1基因p.S267F位点突变可能是CHB患者肝损加重的保护因素。

乙型肝炎病毒; 慢性乙型肝炎; 钠离子-牛磺胆酸共转运多肽; 单核苷酸多态性; 肝功能

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球性公共卫生问题[1-2]。SLC10A1基因编码的钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium-taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)是肝细胞膜上一种具有胆汁酸转运功能的多肽类物质[3]。2012年北京生命科学研究所李文辉团队首次证实NTCP是HBV感染肝细胞的功能受体[4]。随后，Yan等[5]的体外实验发现NTCP基因p.Ser267Phe点突变可导致其HBV受体功能缺失。然而，p.Ser267Phe点突变导致HBV受体功能缺失后的临床意义尚不明确，相关研究也较少。本研究初步探讨SLC10A1基因p.S267F位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)对CHB患者肝功能的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本课题组前期检测了2014年7月-2015年2月在上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心就诊的1 268例HBV感染者SLC10A1基因p.S267F位点的SNPs情况。其中，初治CHB患者共153例，132例p.S267F野生型(C/C型)、21例p.S267F突变型(C/T型)，纳入初治患者作为研究对象。本研究中CHB的诊断均符合我国《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》的诊断标准[6]。排除标准如下：经抗病毒或保肝治疗的患者、伴有其他病毒性肝炎(甲型、丙型、丁型、戊型)、合并HIV感染、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病或遗传代谢性肝病的患者。研究方案符合上海市公共卫生临床中心伦理委员会制定的伦理学标准并得到该伦理委员会批准；本研究中所有研究对象均被告知研究目的并获知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 获取DNA样本：用EDTA抗凝管留取受试者3 ml静脉血。取其中200 μl静脉血，采用TIANamp DNA抽提试剂盒(Biotake公司，北京)，按试剂公司操作说明进行DNA抽提。抽提出的DNA保存在-80 ℃冰箱待用。

1.2.2 SLC10A1基因p.S267F位点SNPs分析：SLC10A1基因p.S267F位点SNPs的检测均采用片长多态性聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)。PCR反应体系为25 μl，包括12.5 μl的2×Taq PCR Mix(西安润德生物有限公司)、2 μl基因组DNA(0.05 mg/ml)、上游引物(5′-ATATGGCAATGAGGAGAAGC-3′)和下游引物(5′-TTCCCTCTGAGTGTATGTGG-3′)各1.0 μl、8.5 μl无菌双蒸馏水。PCR扩增程序如下：94 ℃ 3 min→扩增30个循环(循环程序为94 ℃ 30 s→58 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s)→72 ℃ 10 min。扩增完成后，按公司操作说明使用HphI(新英格兰生物实验室北京有限公司)对DNA进行酶切，获得p.S267F位点的限制性酶切片段。采用3%的琼脂糖凝胶对p.S267F酶切片段进行电泳，随后采用紫外透射光源进行紫外显像。依据紫外显像结果判断NTCP基因在p.S267F位点的SNPs：基因CC型仅有一个长度为204个碱基的片段；基因CT型有3个片段，长度分别为204、120、84个碱基；基因TT型有2个片段，长度分别为120和84个碱基。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析：分别采用T检验和卡方检验比较SLC10A1基因p.S267F位点野生型与突变型CHB患者的年龄、性别构成比和HBV DNA定量值的差异；T检验比较野生型和突变型患者肝功能各项指标间的差异；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 入组患者的基线特征 SLC10A1基因p.S267F位点野生型与突变型CHB患者在年龄和性别构成比方面的差异无统计学意义(P>0.05)；突变型CHB患者血清HBV DNA载量低于野生型CHB患者(P=0.006, 见表1)。

表1 入组患者的基线特征

Tab 1 Baseline characteristics of enrolled patients

野生型突变型统计值P值例数13221男/女87/4515/62．390．611年龄(x±s，岁)36．5±1238．4±111．170．737HBVDNA(log10IU/ml)7．3(3．5～8．4)5．2(2．7～6．8)12．470．006

2.2 SLC10A1基因p.S267F位点野生型与突变型患者的肝功能比较 p.S267F位点突变型CHB患者的ALT、AST、TBIL和DBIL水平均明显低于野生型且差异有统计学意义(P<0.05)；两组患者的ALP、GGT和TBA水平间的差异无统计学意义(P>0.05)。

肝功能指标野生型突变型t值P值ALT(U/L)187．5±123．3115．7±93．489．270．008AST(U/L)166．6±104．2101．4±86．559．540．010TBIL(μmol/L)89．6±72．953．3±45．2129．240．007DBIL(μmol/L)64．7±50．836．6±25．766．150．001ALP(U/L)167．5±93．6 116±64．71．170．587GGT(U/L)105．5±89．299±96．30．190．748TBA(μmol/L)61．4±49．259．7±42．50．020．115

注：ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；TBIL：总胆红素；DBIL：直接胆红素；ALP：碱性磷酸酶；GGT：L-γ-谷氨酰基转移酶；TBA：总胆汁酸。

3 讨论

目前已明确NTCP是HBV进入肝细胞的功能受体，且有多项临床前期研究表明SLC10A1基因p.S267F位点突变(野生型→突变型)会导致NTCP表达水平下降或NTCP与HBV的亲和力降低，进而减少HBV对肝细胞的感染[5,7]。依据临床前期研究结论，不难得出以下科学假设：与SLC10A1基因p.S267F位点野生型患者相比，突变型患者肝细胞膜表面NTCP的表达水平下降或NTCP与HBV的亲和力降低，肝脏内被HBV感染并最终被机体免疫系统识别并破坏的肝细胞的数量相对较少，其肝功能损伤程度较野生型患者轻。然而这只是一种基于临床前期研究得出的科学假设，尚需要临床数据证实。因此我们纳入初治CHB患者，从临床角度观察SLC10A1基因p.S267F位点突变是否会对CHB患者的肝功能产生影响。

从本研究结果看，SLC10A1基因p.S267F位点突变型患者的ALT、AST、TBIL和DBIL水平均明显低于野生型患者，且差异有统计学意义，这印证了“SLC10A1基因p.S267F位点突变型患者肝功能损伤程度较野生型患者轻”的假设，也从临床角度进一步支持SLC10A1基因编码的NTCP为HBV侵入肝细胞的功能受体。ALT、AST、TBIL和DBIL是临床医生判断CHB患者病情严重程度的常用生化指标，突变型患者中这些指标的水平明显低于野生型患者，提示SLC10A1基因p.S267F位点的SNPs与CHB患者的病情严重程度存在相关性，S267F位点突变可能是CHB重症化的保护因素之一。SLC10A1基因p.S267F位点突变型CHB患者血清HBV DNA载量显著低于野生型CHB患者，从临床角度进一步证明了Yan等[5]和Romero等[7]在细胞和动物实验中发现的“SLC10A1基因p.S267F位点突变会导致NTCP表达水平下降或NTCP与HBV的亲和力降低，进而减少HBV对肝细胞的感染”的结论。

NTCP具有TBA转运功能，是调控TBA肠肝循环的关键[8]。目前研究表明肠道重吸收入肝脏的TBA有90%经过NTCP转运，另外10%经过非NA+依赖的有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptide，OATP)转运[9]。SLC10A1基因p.S267F位点突变导致NTCP表达水平降低，会不会通过影响TBA的肠肝循环导致血中TBA水平升高呢？我们的临床数据显示SLC10A1基因p.S267F位点野生型与突变型CHB患者的TBA水平无明显差异。Pan等[10]报道SLC10A1基因p.S267F位点T/T型突变的患者，其NTCP的胆汁酸转运功能几乎完全丧失，然而这部分患者临床上并未出现血胆汁酸水平的升高，与我们的研究结果一致。Li等[11]的研究发现SLC10A1基因p.S267F位点突变导致NTCP表达下调后，机体可通过上调OATP的表达水平，通过OATP对TBA转运进行充分的代偿。总而言之，我们的研究表明SLC10A1基因p.S267F位点突变对CHB患者的血胆汁酸水平影响不大，机制可能与OATP的充分代偿有关。

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(责任编辑：王全楚)

Influence of p.S267F single nucleotide polymorphisms in SLC10A1 gene on the liver function of chronic hepatitis B patients

LI Qiang1, YAN Jingjing2， ZHUO Qibin1, ZHANG Shuye2, CHEN Liang1

1.Department of NO.1 Hepatitis; 2.Department of Scientific Research, Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University, Shanghai 201508, China

Objective To investigate influence of p.S267F single nucleotide polymorphisms (SNPs) in SLC10A1 gene on the liver function of chronic hepatitis B (CHB) patients. Methods One hundred and fifty-three initial treatment CHB patients including 132 cases of p.S267F wild type (C/C) and 21 cases of p.S267F mutant (C/T) were enrolled. The differences of liver function between patients of C/C genotype and C/T genotype were compared. Results The level of ALT, AST, TBIL and DBIL of patients with p.S267F mutant type was lower than that of patients with p.S267F wild(P<0.05). There was no significant difference between the two groups in ALP, GGT and TBA(P>0.05).Conclusion The degree of liver damage of patients with p.S267F mutant is lower than that of patients with p.S267F wild type. The p.S267F mutant may be a protective factor of aggravation of liver function of patients with CHB.

Hepatitis B virus; Chronic hepatitis B; Sodium taurocholate cotransporting polypeptide; Single nucleotide polymorphism; Liver function

上海市科委“科技创新行动计划”医学与农业领域重点项目(13401902100)；上海市市级医院新兴前沿技术联合攻关项目(SHDC12015129)；上海市公共卫生临床中心院级课题(201504)

李强，硕士，研究方向：慢性肝病治疗策略优化。E-mail： liqiang66601@163.com

陈良，教授，硕士，研究方向：慢性肝病治疗策略优化。E-mail： chenliang@shaphc.org

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.10.026

512.6+2

A

1006-5709(2016)10-1179-03

2015-12-29