李 琴，胥 明，卢水蓉，孙钦娟，周卫宁

上海市同济大学附属东方医院消化内科，上海 200123

溃疡性结肠炎诱发结肠癌小鼠模型中RegⅣ的表达及预测价值

李 琴，胥 明，卢水蓉，孙钦娟，周卫宁

上海市同济大学附属东方医院消化内科，上海 200123

目的 通过检测再生基因Ⅳ(Regenerating gene Ⅳ,Reg Ⅳ)和Ki67在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)诱发结肠癌小鼠模型中的表达，探讨Reg Ⅳ对UC诱发结肠癌早期诊断、判断预后的价值。方法 60只BALB/c小鼠分为正常对照组、模型组，采用偶氮氧甲烷(Azoxymethane, AOM)联合葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium, DSS)的方法建立UC癌变的小鼠模型，HE染色观察小鼠结肠组织病理变化，采用免疫组化检测不同时期肠道组织中Ki67和Reg Ⅳ蛋白的表达，实时荧光定量PCR检测此两项指标mRNA的表达。结果 癌变组小鼠结肠黏膜中Ki67的表达水平较其他组明显升高(P<0.05)，轻-中度不典型增生组Reg Ⅳ的表达水平较癌变组明显升高(P<0.05)，免疫组化法统计学结果与RT-PCR一致。结论 RegIV在肠黏膜癌变过程中表达过量可能先于Ki67，提示Reg Ⅳ可作为预测 UC诱发结肠癌的良好分子标志物。

再生基因Ⅳ；Ki67；溃疡性结肠炎；结肠癌；小鼠模型

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种慢性反复发作的非特异性结肠炎，近年来发病率呈升高趋势，随着病程的延长，常发生不同程度的不典型增生，较易转化为癌组织。再生基因Ⅳ(Regenerating islet-derived family member 4, RegⅣ)属于钙依赖性凝集素超家族成员之一,选择性表达于胃肠道，炎症或肿瘤发生时其表达明显增加。Ki67是评估细胞增殖动力学的有效指标，表达比率高即细胞增殖能力强。因此，我们通过检测各期Ki67的表达水平，以区分不同增殖能力的样本，并采用免疫组化和RT-PCR方法检验RegⅣ在不同样本中的表达情况，以揭示其与UC癌变演进的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雌性BALB/c小鼠60只，7～8周龄，体质量18.5～22.5g，购自上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK(沪)2007-0003]。葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium, DSS)(MP公司，分子量3.6～5万Da)，偶氮氧甲烷(Azoxymethane, AOM)(Sigma公司)，鼠抗人RegⅣ单克隆抗体购自美国sanata公司，PowerVisionTM即用型二步法小鼠免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购自南京塞泓瑞生物技术有限公司。Trizol-reagent、RT-reagent逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量试剂均购自大连TaKaRa公司。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。LC480 Real Time PCR扩增仪购自美国罗氏诊断产品(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 UC癌变小鼠模型的建立[1]：60只BALB/c小鼠随机分为对照组(15只)和模型组(45只)。对照组第1天予以0.9%生理盐水10 mg/kg腹腔注射，普通饮水9周。模型组第1天予AOM 10 mg/kg腹腔注射，继续自由饮用4%DSS 1周，再普通饮水2周，饮用DSS及普通水重复3个循环。模型组自实验开始每3周处死15只小鼠，第9周末两组小鼠全部处死。最初购买75只小鼠，建模过程中死亡及剔除15只，取回盲部至直肠全部肠段，放大镜下观察后，截取溃疡或糜烂最明显处，沿纵轴切开，置于10%甲醛固定中待测，其余冻存于-80 ℃冰箱待测。

1.2.2 HE染色：将小鼠结肠组织经甲醛固定24 h后取出，予以蒸馏水冲洗后脱水、石蜡包埋、切片，常规HE染色，封片，光镜下观察病理情况。

1.2.3 免疫组织化学法：对照组和模型组均进行免疫组化SABC染色检测，操作步骤严格按照免疫组化试剂盒说明书进行。由2名经验丰富的病理医师独立读片，取平均值作为最终评分。结果评判采用半定量积分法，每组8个组织点阵，每个点阵连续观察3个高倍镜视野。每个视野计数100个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分数并赋值，≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥75%为4分；观察着色强度并赋值，无着色为0分，浅黄着色为1分，黄色为2分，棕黄着色为3分。两值相乘为最终结果，0～3分为阴性，4～12分为阳性。

1.2.4 实时荧光定量PCR(RT-PCR)：参照Trizol试剂盒说明书提取小鼠结肠组织总mRNA；逆转录试剂盒合成cDNA，利用荧光定量PCR试剂盒检测各标本中的Ki67和 RegⅣmRNA 表达水平，内参基因为 GAPDH。基因序列设计由上海生工合成引物。分别是：Ki67上游：5′-AAAGTGCCCAAGCCATAGA-3′，Ki67下游：5′-ACACCATTTGCCAGTTCCTC-3′，RegⅣ上游：

5′-CTGAAGCTAACAGGGGCGAG-3′，RegⅣ下游:5′-TGCAAATCTGCAAGACCTCC-3′。RT-PCR操作步骤严格按照TaKaRa公司试剂盒说明书进行。荧光定量 PCR 结果分析：基因的相对定量通过2-△△CT表示，其中△△CT=△CT实验组-△CT对照组；而△CT=△CT目的基因-△CT内参。3个指标均以正常对照组中最大值作为分界点判断阳性。

2 结果

2.1 HE染色观察各组不典型增生的情况 第3周末病理表现为急性肠炎，第6周末多呈轻-中度不典型增生改变，第9周末实验组小鼠均有肿瘤形成，成瘤率高，且病理类型为重度不典型增生或原位癌。小鼠结肠标本常规固定包埋切片、HE染色后观察，UC的确立标准包括：炎细胞浸润、腺体缺失、隐窝脓肿、黏膜溃疡及纤维化。不典型增生分为轻、中及重度不典型增生，癌分为原位癌和进展期癌。

2.2 Ki67和RegⅣ蛋白在不同病变结肠组织中的表达情况 Ki67蛋白癌变组与正常组、UC组和轻-中度不典型增生组比较，差异均有统计学意义(χ2=7.5、22.5、52.5，P<0.05)。

RegⅣ蛋白：轻-中度不典型增生组与正常组、UC组、癌变组的表达差异均有统计学意义(χ2=30.0、40.0、60.0，P<0.05)，其余各组之间差异无统计学意义。轻-中度不典型增生组表达明显高于癌变组。

2.3 Ki67和RegⅣ mRNA在不同病变结肠组织中的表达情况 RT-PCR检测结果：Ki67分别在正常组、对照组的第3周末(UC组)、第6周末(轻-中度不典型增生组)、第9周末(癌变组)的表达水平渐进性升高,第9周末与其余各组两两比较，差异均有统计学意义(F=28.55、9.24、6.58，P<0.05)。在以上4组中，RegⅣ在第6周末组中表达最高，其高于第9周末中的表达，第6周末组与其余3组两两比较，差异均有统计学意义(F=4.925、5.859、7.091，P<0.05)。

图1 免疫组化检测Ki-67(400×)； 图2 免疫组化检测RegⅣ(400×) A：正常对照组；B：UC组；C：癌变组

Fig 1 Ki-67 detected by immunohistochemical (400×); Fig 2 RegⅣ detected by immunohistochemical (400×) A: control group; B: UC group; C: cancerous group

表1 Ki67和RegIV蛋白在不同阶段肠黏膜中的表达情况[例数(%)]

Tab 1 The expressions of Ki67 and Reg Ⅳ protein in the intestinal mucosa in different stages [n(%)]

组别例数Ki67RegIV正常对照组150．862±0．1051．292±0．237UC组151．560±0．0663．167±0．210轻-中度不典型增生组152．370±0．0736．601±0．468癌变组155．250±0．1274．221±0．204

3 讨论

UC是一种慢性非特异性肠炎，近10年来在我国发病率呈上升趋势。UC患者并发结肠癌的风险与病程呈正比，患病10年结直肠癌的发生率为2%，20年为8%，30年以上达18%[2]。癌变在炎症性肠病患者致死病因中占10%～15%，对癌变的监测成为了突出问题。因此,探索UC癌变的发病机制，寻找UC癌变的早期肿瘤标志物及新的治疗靶标，成为研究热点之一。

肿瘤的发生和演变是一个错综复杂的生物学过程，涉及癌基因突变活化、抑癌基因表达失调、凋亡调节紊乱等诸多改变。Ki67基因位于人类染色体10q25上，由分子量为345 kD和395 kD的两条多肽链组成，其功能与细胞的有丝分裂有关。它表达于除G0期外的其他所有细胞周期中，其表达高低反映细胞增殖的程度，是判断预后的有效指标之一[3]。鉴于检测Ki67是评估结肠癌细胞增殖状态的简便方法，我们选取它作为UC癌变的参考对照，通过UC癌变过程中结肠组织表达Reg Ⅳ与Ki-67的分析比较，为寻找UC诱发结肠癌早期预防、早期诊断及评估转归和预后的生物标记建立基础。

2001年Hartupee等[4]首次对炎症性肠病库的高流通量序列分析时筛选出RegⅣ，归为钙依赖凝素超家族成员。Reg Ⅳ定位于1p12-13.1，包含5个内含子和6个外显子。翻译出的前蛋白产物分子量为17 kD，由158个氨基酸组成, 包含22个氨基酸的信号肽和1个保守的钙依赖性糖识别域(calcium-dependent carbohydrate-recognition domain, CRD),与其他Reg蛋白有43%～47%的同源性。Reg Ⅳ蛋白选择性表达于正常胰腺、小肠上皮神经内分泌细胞和胃黏膜的壁细胞中[5-7]。赖明广等[8-9]报道，UC患者肠黏膜的腺管上皮和杯状上皮细胞中Reg Ⅳ的表达显著增加，可作为预测疾病活动度的一个独立指标。

RegⅣ可能在结肠的癌前病变中发挥促进作用，但对于RegⅣ与UC癌变发生、发展的研究处于起步阶段，确切的分子机制尚未明确。据Bishnupuri等[10-11]报道，将重组的人RegⅣ基因转染至结肠腺癌细胞系HT29和HCT116后，癌细胞数目呈剂量依赖性增长，并引发了Akt蛋白的丝氨酸、苏氨酸和表皮生长因子受体酪氨酸的快速磷酸化。采用荧光素酶基因检测发现，RegⅣ可以通过Akt蛋白和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)介导的信号通路增强活化蛋白-1(AP-1)转录因子的活性,AP-1则通过下游靶基因的表达参与细胞基质的降解、肿瘤新生血管等环节。另外,抗凋亡基因(Bcl-2、 Bcl-XL、存活素和基质溶解因子等)表达量显著升高，提示预后不良。由此研究者推断, 在结肠组织癌变进程中RegⅣ可以通过增加Bcl-2、Bcl-XL、存活素等的表达水平激活EGFR/Akt/AP-1信号通路，从而提高了癌细胞的存活率。

本研究着眼于UC癌变不同阶段的组别中统计Ki67和RegⅣ的表达情况，Ki67在正常组、对照组的第3周末(UC组)、第6周末(轻-中度不典型增生组)、第9周末(癌变组)的表达水平逐步升高,差异具有统计学意义，反映了小鼠模型UC癌变过程中细胞增殖状态的变化。同时发现与Ki67随着时间推移渐进性升高不同， RegⅣ在轻-中度不典型增生组中表达最高,且表达水平与其他各组有显著性差异(P<0.05)，提示RegⅣ在肠黏膜癌变的过程中表达过量可能先于Ki67，免疫组化法统计学结果与RT-PCR一致。由此推断，Reg Ⅳ是一个提示癌变风险较大的早期生物学指标。在病程较长和炎症活动频发的UC高危人群中，早期监测结肠黏膜RegⅣ表达意义重大，可作为临床判断结肠癌生物学行为的一项重要指标，但其作用机制还有待进一步探讨。

[1]郑海明, 赵航, 郑萍. 葡聚糖硫酸钠和偶氮氧甲烷建立溃疡性结肠炎癌变的小鼠模型[J].实验动物与比较医学, 2012, 1(5): 47-50. Zheng HM, Zhao H, Zheng P. A novel mouse model for ulcerative colitis-associated carcinogenesis induced by Azoxymethane and Dextran Sulfate Sodium [J]. Laboratory Animal and Comparative Medicine, 2012, 1(5): 47-50.

[2]Westbrook AM, Szakmary A, Schiestl RH.Mechanisms of intestinal inflammation and developmen to fassociated cancers: lessons learned from mouse models [J]. Mutat Res, 2010, 705(1): 40-59.

[3]Going JJ, Keith WN, Neilson L, et al．Aberrant expression of minichromosome maintenance proteins 2 and 5, and Ki-67 in dysplastic squamous oesophageal epithelium and Barrett’s mucosa [J]. Gut, 2002, 50(3): 373-377.

[4]Hartupee JC, Zhang H, Bonaldo MF, et al. Isolation and characterization of a cDNA encoding a novel member of the human regenerating protein family: RegⅣ [J]. Biochim Biophys Acta, 2001, 1518(3): 287-293.

[5]Kämäräinen M, Heiskala K, Knuutila S, et al. RELP, a novel human REG-like protein with up-regulated expression in inflammatory and metaplastic gastrointestinal mucosa [J]. Am J Pathol, 2003, 163(1): 11-20.

[6]Violette S, Festor E, Pandrea-Vasile I, et al. Reg Ⅳ, a new member of the regenerating gene family,is overexpressed in colorectal carcinomas [J]. Int J Cancer, 2003, 103(2): 185-193.

[7]Oue N, Mitani Y, Aung PP, et al.Expression and localization of RegⅣ in human neoplastic and non-neoplastic tissues: RegⅣ expression is associated with intestinal and neuroendocrine differentiation in gastric adenocarcinoma [J]. J Pathol, 2005, 207(2): 185-198.

[8]赖明广, 张亚历.RegIV在溃疡性结肠炎中的表达及其对疾病活动度的预测价值[J].现代消化及介入诊疗, 2010, 15(2): 71-73. Lai MG, Zhang YL. Increased expression of Reg Ⅳ in ulcerative colitis provides a potential predictor of disease activity [J]. Modern Digestion & Intervention, 15(2): 71-73.

[9]Nanakin A, Fukui H, Fujii S, et al. Expression of theREG IV gene in ulcerative colitis [J]. Lab Invest, 2007, 87(3): 304-314.

[10]Bishnupuri KS, Luo Q, Murmu N, et al. Reg IV activates the epidermal growth factor receptor/Akt/AP-1 signaling pathway in colon adenocarcinomas [J]. Gastroenterology, 2006, 130(1): 137-149.

[11]Bishnupuri KS, Luo Q, Korzenik JR, et al. Dysregulation of Reg gene expression occurs early in gastrointestinal tumorigenesis and regulates anti-apoptotic genes [J]. Cancer Biol Ther, 2006, 5(12): 1714-1720.

Expression and predictive value of RegⅣ in colon cancer mice model induced by ulcerative colitis

LI Qin, XU Ming, LU Shuirong, Sun Qinjuan, ZHOU Weining

Department of Gastroenterology, Dongfang Hospital, Tongji University, Shanghai 200123, China

Objective To evaluate the early diagnostic and predictive value of Regenerating gene Ⅳ (Reg Ⅳ) in ulcerative colitis (UC) cancerization by detecting Reg Ⅳ and Ki67 in UC cancerization mice model.Methods Sixty mice were divided into the experimental group and the control group in the study. UC cancerization mice model was set up byazoxymethane combined with dextran sulfate sodium.Colon tissue pathological changes were observed by HE dyeing. Gene expression was investigated by immunohistochemistry.mRNA expression was investigated by reversetranscription-PCR.Results Ki67 expression in colonic mucosa of colon cancer group mice was obviously higher than other groups (P<0.05).Reg Ⅳ expression in light to moderate dysplasia group was apparently higher than that in the cancerous group (P<0.05). Statistical results of immunohisto-chemical were consistent with RT-PCR.Conclusion The high expression of Reg Ⅳ may precede Ki67 in cancerous process of intestinal mucosal.Reg Ⅳ level is a good cancer molecular marker for predicting the cancerization in UC patients.

Regenerating gene Ⅳ; Ki67; Ulcerative colitis; Colon cancer; Mice model

李琴，主治医师，硕士，研究方向：炎症性肠病的发病机制。E-mail：xybd@sh163.net

胥明，副主任医师，博士，研究方向：炎症性肠病的发病机制。E-mail：jessiegod@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.10.010

R574.62

A

1006-5709(2016)10-1116-04

2016-09-04