周 颖, 吕 红, 汪红英, 钱家鸣

1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院消化科，北京 100730； 2.中国医学科学院肿瘤医院 分子肿瘤学国家重点实验室

论著·炎症性肠病

维生素D3对小鼠实验性结肠炎和炎症相关结直肠癌的保护作用

周 颖1, 吕 红1, 汪红英2, 钱家鸣1

1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院消化科，北京 100730； 2.中国医学科学院肿瘤医院 分子肿瘤学国家重点实验室

目的 探究预防性补充维生素 D3(VitD3)对小鼠急性实验性结肠炎(AC)和炎症相关结直肠癌(colitis-associated CRC, CAC)的保护作用及相关机制。方法 采用葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)诱导小鼠实验性结肠炎模型，氧化偶氮甲烷(AOM)联合DSS诱导CAC模型，干预组VitD3定期灌胃。机制研究采用实时荧光定量PCR和免疫组化染色法。结果 VitD3干预后，AC模型小鼠的结肠炎症减轻，其中结肠组织TNF-α表达和结肠上皮细胞凋亡减少。CAC模型小鼠的成瘤体积变小，其中β-catenin的表达水平和入核减少。结论 预防性补充VitD3对小鼠结肠炎症和CAC形成具有保护作用。

维生素D3；实验性结肠炎；炎症相关结直肠癌

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)在中国及亚洲的发病率呈逐年上升趋势。不同于西方国家，中国的IBD中溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)显著多于克罗恩病(Crohn’s disease, CD)[1]。大量研究提示UC是结直肠癌(colorectal cancer, CRC)发生的危险因素[2]。这种由结肠炎症演变的CRC，其发病机制与散发型CRC有所不同，故称为炎症相关结直肠癌(colitis-associated CRC, CAC)。维生素D(Vitamin D, VitD)是甾体类激素骨化三醇的前体，近年来发现除调节钙、磷代谢外，VitD对人体还具有免疫调节、抑制炎症和预防癌症等作用[3]。本研究通过对急性实验性结肠炎(acute experimental colitis, AC)和CAC模型小鼠预防性补充VitD3，探究VitD3对结肠炎症和CAC的保护作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 动物和材料 实验动物为雄性C57BL/6小鼠50只(6～8周龄，体质量20～25 g)，购自维通利华公司。葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)分子量36 000～50 000，购自MP Biomedicals公司。VitD3采用胆维丁乳，商品名为“英康利”。氧化偶氮甲烷(Azoxymethane, AOM)购自Sigma-Aldrich公司。Trizol和逆转录试剂盒均购自Lifetechnology公司。SYBR Green染料采用Takara公司的SYBR Premix Ex TaqII。Cleaved Caspase-3和β-catenin的一抗均购自Cell Signaling Technology公司。

1.2 动物模型和分组

1.2.1 小鼠AC模型分为以下三组：(1)空白对照组(Control组，5只)；(2)AC模型组(AC组，10只)，给予含2.5% DSS的饮用水5 d，第10天处死小鼠；(3)VitD干预组(AC+VitD组，10只)，除DSS处理外给予VitD3定期灌胃，剂量为每周32.5 IU/g，灌胃从建模前2周持续至小鼠处死。小鼠在建模和喂养过程中无死亡。

1.2.2 小鼠CAC模型分为以下三组：(1)空白对照组(Control组，5只)；(2)CAC模型组(CAC组，10只)，予腹腔注射12.5 mg/kg AOM，1周后给予含2.5% DSS的饮用水5 d，第12周末处死小鼠;(3)VitD干预组(CAC+VitD组，9只)，除上述诱导成瘤外予定期VitD3灌胃，方法同上。VitD干预组中1只小鼠因灌胃误吸死亡。

1.3 结肠炎症评估 给予小鼠DSS后第0～10天每天评估疾病活动指数(Disease Activity Index, DAI)(见表1)。处死小鼠取出结肠后进行大体结肠炎评分(见表2)。根据Cooper等[4]的“螺丝状”(Swiss Roll)方法，请病理科医生进行病理炎症评分(见表3)。取一段长0.5 cm的新鲜结肠组织，根据比色法测定髓过氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)活性[5]。

表1 疾病活动指数DAI计算方法

Tab 1 Disease Activity Index(DAI) evaluation

评分体质量下降大便性状便潜血00成形-11%～5%//25%～10%半成型，不粘于肛门+～+++310%～20%//4>20%液体状，粘于肛门口肉眼血便

表2 小鼠实验性结肠炎大体评分

Tab 2 Macroscopic colitis score in mice

评分表现 0正常结肠组织1肠壁轻度增厚，无充血2肠壁中度增厚，伴充血3肠壁中度增厚，僵硬，充血4肠壁重度增厚，僵硬，充血

1.4 结肠成瘤判断 计算结肠肉眼可见的成瘤数(直径D≥1 mm)，用游标卡尺测定肿瘤平均直径，计算瘤负荷(即所有肿瘤的平均直径之和)。结肠切片请病理科医生判断是否形成肿瘤，如有肿瘤则进一步判断肿瘤累及的层次及异型性。根据肿瘤平均直径(D)将成瘤分为大(D>4 mm)、中(2 mm

表3 小鼠实验性结肠炎病理评分

Tab 3 Histological colitis score in mice

评分炎症程度损伤范围隐窝破坏0无无无1轻度黏膜层基底层1/32中度黏膜下层基底层2/33重度全层仅表面上皮完整4//上皮、基底层均破坏

1.5 实验方法 实时荧光定量PCR：Trizol一步法提取小鼠结肠组织总RNA，按试剂盒说明书进行逆转录。实时荧光定量PCR根据SYBR Green I方法进行相对定量分析。引物序列及PCR产物长度见表4。免疫组织化学(Immunohistochemical, IHC)染色：按常规步骤进行，抗原修复采用微波法，一抗4 ℃过夜，二抗采用二步试剂法。小鼠血清25羟维生素D的测定:采用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法(Isotope dilution ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, ID.UPLC/MS/MS)，该方法可同时检测25(OH)D3和25(OH)D2；由北京协和医院检验科代为检测。

表4 实时荧光定量PCR的引物序列及产物长度

Tab 4 Primer sequence and product length in RT-PCR

合成物引物序列(5′⁃3′)产物长度(bp)TNF⁃αForward：CAGCCGATGGGTTGTACCTT100Reverse：ATAGCAAATCGGCTGACGGTCyclinD1Forward：CAAGTGTGACCCGGACTGC149Reverse：CACATCTCGCACGTCGGTβ⁃cateninForward：ATGGAGCCGGACAGAAAAGC111Reverse：TGGGAGGTGTCAACATCTTCTTGAPDHForward：AACTTTGGCATTGTGGAAGG223Reverse：ACACATTGGGGGTAGGAACA

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。计量资料比较采用t检验，检验水准α=0.05。分类资料比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VitD3抑制小鼠实验性结肠炎 VitD3定期灌胃可使小鼠血清25(OH)D水平显著升高(见图1A)。AC模型构建成功，AC组和AC+VitD组在症状出现时间、DAI进展速度及DAI峰值上基本一致，但AC+VitD组结肠炎症状较AC提前恢复(见图1B)。AC+VitD组的结肠大体评分、病理评分和MPO活性均较AC组下降(病理评分P=0.06，余P均<0.05，见图1C～1E)。总体来说，AC组小鼠结肠中重度炎症多见，肌层受累者多于AC+VitD组，隐窝破坏更严重(见图1F)。

2.2 VitD3抑制小鼠结肠组织TNF-α表达和结肠上皮细胞凋亡 测定各组小鼠结肠组织中TNF-α的mRNA表达水平，AC组和AC+VitD组较空白对照组均显著升高(P<0.05)，AC+VitD组TNF-α表达较AC组显著降低(P<0.05，见图2A)。对结肠上皮细胞(intestinal epithelial cell, IEC)进行活化的Caspase 3(Activated Caspase 3)免疫组织化学染色，AC组小鼠IEC凋亡较空白对照组显著增加，主要分布于隐窝上1/3处；AC+VitD组IEC凋亡较AC组显著减少，仅在隐窝顶部可见凋亡细胞，但仍多于空白对照组(见图2B)。

注：*P<0.05。

图1 VitD3对小鼠实验性结肠炎症的抑制作用 A：血清25(OH)D浓度；B：建立AC模型后DAI的变化；C：实验性结肠炎大体评分；D：实验性结肠炎病理评分；E：结肠组织MPO活性；F：典型的结肠大体和病理表现(HE 100×)

Fig 1 VitD3 suppressed experimental colitis in mice A: concentration of serum 25(OH)D level; B: change of DAI after the establishment of AC model; C: macroscopic colitis score; D: histological colitis score; E: MPO level of colonic tissue; F: typical macroscopic and histological features (HE 100×)

注：*P<0.05。

图2 VitD3对小鼠结肠组织TNF-α表达和结肠上皮细胞凋亡的抑制作用 A：结肠上皮TNF-α mRNA相对表达水平；B：活化的Caspase 3在IEC内的表达分布(IHC 400×)

Fig 2 VitD3 reduced colonic TNF-α expression and intestinal epithelial cell apoptosis in mice A: expression of TNF-α mRNA of colon; B: expression of activated Caspase 3 in IEC (IHC 400×)

2.3 VitD3抑制小鼠CAC的肿瘤大小 评估各组小鼠的结肠成瘤情况，CAC组10只小鼠均可见结肠肉眼成瘤，CAC+VitD组9只小鼠中8只成瘤，成瘤个数分别为(5±2)个和(3.8±3.99)个，瘤负荷分别为 (1.28±0.9) cm和(0.83±0.91) cm。CAC+VitD组的成瘤个数和瘤负荷较CAC组均有下降趋势(见图3A)，但差异无统计学意义(P=0.08)。CAC组中大、中、小肿瘤的组成比分别为10%、54%和36%，而CAC+VitD组为0、35%和65%，差异有显著统计学意义(P<0.001, 见图3B)。

2.4 VitD3抑制小鼠结肠组织β-catenin表达水平及其入核 检测小鼠结肠组织中β-catenin mRNA表达情况，与CAC组相比， CAC+VitD3组β-catenin mRNA表达水平显著下降(见图4A，P<0.05)。进一步检测β-catenin下游产物Cyclin D1的表达情况，CAC+VitD组的Cyclin D1 mRNA 表达水平较CAC组显著降低(P<0.05，见图4B)。β-catenin的免疫组化染色结果显示，正常结肠组织中β-catenin主要表达于胞浆和细胞膜上，细胞核内很少表达；CAC组的结肠肿瘤内，细胞膜上β-catenin表达消失，细胞核内表达显著增加；CAC+VitD组的结肠肿瘤仍可见细胞膜上β-catenin表达，细胞核内的表达量也低于CAC组(见图4C)。

注：***P<0.001。

图3 VitD3对小鼠CAC肿瘤大小的抑制作用 A：典型的结肠大体成瘤情况；B：大(D>4 mm)、中(2 mm

Fig 3 VitD3 reduced tumor size in CAC mice model A: tumor formation of typical macroscopic CAC; B: proportion of Large(D>4 mm), medium(D>4 mm) and small(D≤2 mm) sized tumors

注：*P<0.05。

图4 VitD3对小鼠结肠组织β-catenin表达水平及其入核的抑制作用 A：β-catenin mRNA的相对表达水平；B ：Cyclin D1 mRNA的相对表达水平；C：β-catenin在结肠上皮细胞内的表达分布(IHC 400×)

Fig 4 VitD3 suppressed colonic β-catenin expression and its nuclear localization A: β-catenin mRNA level; B: Cyclin D1 mRNA level; C: β-catenin expression in IEC(IHC 400×)

3 讨论

目前VitD对CRC的化学预防作用尚不明确，虽然流行病学数据和临床前研究提示补充VitD、升高血清25(OH)D水平能预防结直肠肿瘤，但为数不多的来自人群的随机对照研究并未发现类似的保护作用[6-7]。但已有的研究只关注了散发型CRC。IBD相关结直肠癌患者病例较少见，从结肠炎发展至CAC的过程多在10年以上，难以在IBD人群中开展前瞻性的CAC干预性研究。因此动物模型是研究CAC预防的有效方式。目前VitD对CAC预防作用的动物研究尚不多。采用AOM-DSS诱导的小鼠CAC模型，Hummel 等[8]发现给予C56BL/6小鼠饲料中添加VitD3可预防结肠的癌前病变，且预防作用与小鼠血清25(OH)D3浓度呈正相关，但该研究的终点指标是癌前病变而非结直肠癌。另一研究采用DMH联合DSS诱导小鼠CAC模型，饲料中添加VitD3联合二甲双胍可显著抑制结肠成瘤[9]。我们的研究采用单一VitD3作为干预药物，发现VitD3不仅能抑制结肠炎症，并首次证实VitD3能抑制小鼠CAC的成瘤大小。但本研究中VitD3干预并不影响CAC的病理学成瘤评估，两组均为中分化的黏膜内癌。

已有研究表明VitD缺乏的小鼠更易出现实验性结肠炎，补充VitD及其类似物能减轻结肠炎症[5,10]。本课题组曾用TNBS诱导大鼠结肠炎，VitD干预也有类似结果[11]。本研究再次证实，预防性补充VitD3可以使小鼠血清25(OH)D浓度升高，结肠炎症水平下降。机制方面，本研究检测了VitD3干预前后TNF-α、IL-6、IL-21等多个炎症因子的表达情况，只有TNF-α在VitD3干预后表达显著下降。这也佐证了TNF-α是IBD发病机制中的重要炎症因子，TNF-α单抗是IBD治疗的主要生物制剂。既往研究发现VitD/维生素D受体(VDR)信号通路在IBD中主要参与免疫调节[12]，但近期新研究提出VitD能保护肠上皮黏膜屏障的完整性，从而减少肠腔内促炎物质(细菌及其产物)进入组织[13]。我们的研究发现VitD干预能抑制结肠上皮细胞凋亡，这提示VitD可能通过抑制IEC凋亡来实现对肠上皮黏膜屏障的保护作用。

Wnt/β-catenin信号通路的突变在散发结直肠癌的发病机制中占有核心作用，β-catenin促进结肠癌发生的主要机制是β-catenin从胞浆入核，进而促进其下游基因的转录。越来越多的研究发现该信号通路在CAC中也存在异常[14]。本实验室曾用免疫组化染色检测UC、UC癌变、结肠绒毛管状腺瘤和CRC患者结肠肿瘤标本的APC、Wnt1、β-catenin表达阳性率，结果显示UC和UC癌变标本β-catenin 的阳性率显著高于腺瘤和结直肠癌[15]。体外实验还发现，给予结肠癌细胞HCT116 TNF-α和IL-6刺激，可促进细胞内β-catenin表达和入核[16]。Palmer等[17]发现β-catenin是VitD抑制CRC细胞生长、增殖的重要机制，给予结肠癌细胞系SW480以1,25(OH)2D3处理，可以抑制β-catenin表达，VDR还能结合β-catenin抑制其入核。本研究发现，在CAC动物模型中VitD3使结肠β-catenin表达下降、入核减少，并下调β-catenin的转录产物Cyclin D1。Cyclin D1是细胞周期蛋白家族成员之一，其功能是促进细胞周期G1/S的进展，VitD3干预后Cyclin D1表达的下降也进一步佐证了ViD3对肿瘤的抑制作用。

总而言之，VitD3作为一种体内的生理性维生素，对结肠炎症和CAC形成具有一定的保护和预防作用，可能是延缓CAC发展的因素之一。

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(责任编辑：马 军)

Protective role of Vitamin D3 in experimental colitis and colitis-associated colorectal cancer in mice

ZHOU Ying1, LV Hong1, WANG Hongying2, QIAN Jiaming1

1.Department of Gastroenterology, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100730; 2.Key Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Hospital Chinese Academy of Medical Science, China

Objective To explore whether Vitamin D3 (VitD3) palys a protective role in acute experimental colitis(AC) and colitis-associated colorectal cancer (CAC) in mice and its mechanisms. Methods Dextran sodium sulfate(DSS) was used to induce AC mouse model. Azoxymethane and DSS were used to induce CAC model. VitD3 was given by gastric lavage. RT-PCR and immunohistochemical (IHC) staining were used in mechanism studies. Results VitD3 reduced colitis severity in AC model in which colonic TNF-α expression and intestinal epithelial cell apoptosis were decreased significantly after VitD3 intervention. VitD3 reduced tumor size significantly in CAC model, in which colonic β-catenin expression and nuclear localization were decreased significantly. Conclusion VitD3 palys a protective role in experimental colitis and CAC in mice.

Vitamin D3; Experimental colitis; Colitis-associated colorectal cancer

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.10.007

2011年高等学校博士学科点专项科研基金(20111106110009)，卫生行业科研专项项目(201002020)

周颖，医学博士，研究方向：炎症性肠病。E-mail：zhouying07@qq.com

钱家鸣，博士生导师，主任医师，研究方向：炎症性肠病。E-mail：qianjiaming1957@126.com

R574.62；R735.3+7

A

1006-5709(2016)10-1101-05

2016-08-10