乌司他丁对溃疡性结肠炎小鼠模型炎症抑制作用及机制研究
2016-06-01胡丽红
胡丽红, 李 晴, 曲 波
哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科, 黑龙江 哈尔滨 150086
乌司他丁对溃疡性结肠炎小鼠模型炎症抑制作用及机制研究
胡丽红, 李 晴, 曲 波
哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科, 黑龙江 哈尔滨 150086
目的 探讨乌司他丁是否可通过对NF-κB活性的抑制，起到治疗溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)的作用。方法 24只BALB/C小鼠以DSS法建立UC小鼠模型，造模后随机分为模型对照组、柳氮磺吡啶治疗组、柳氮磺吡+乌司他丁治疗组，每组8只，另8只正常小鼠设为正常对照组(饮用蒸馏水)。于用药后7 d对小鼠进行相关指标测定：疾病活动指数(DAI)、结肠组织病理学改变、血清中ALB、C反应蛋白、TNF-α的表达、结肠黏膜中SOD、NF-κB的表达。结果 用药后各组小鼠DAI、C反应蛋白、TNF-α、NF-κB对比：正常对照组<柳氮磺吡啶+乌司他丁治疗组<柳氮磺吡啶治疗组<模型对照组；ALB、SOD的对比：正常对照组>柳氮磺吡啶+乌司他丁治疗组>柳氮磺吡啶治疗组>模型对照组。结论 乌司他丁可明显抑制NF-κB的表达，对UC的治疗效果明显优于单纯使用柳氮磺吡啶。
乌司他丁；小鼠；溃疡性结肠炎；NF-κB；治疗
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种病因和发病机制尚不明确的慢性非特异性肠道炎性病变,由于UC的病因不够明确，治疗上也缺乏特异性药物，世界卫生组织将其列为难治性疾病之一。
在UC中，活化的NF-κB可调节与UC发生、发展相关的促炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)等的产生和释放，加重肠道的炎性反应[1]。由此提示NF-κB的激活在调节免疫及炎性反应中起着关键作用，抑制NF-κB的活性可以起到治疗UC的作用[2]。寻找靶向抑制NF-κB活性的方法用于UC治疗，具有非常重大的科学意义和社会价值。
乌司他丁主要成分为健康男性新鲜尿液中分离纯化出的糖蛋白,作为蛋白酶抑制剂,在抑制溶酶体酶释放、稳定溶酶体膜、清除氧自由基及抑制炎性介质释放方面有显著作用[ 3-4 ]。乌司他丁是否可通过抑制NF-κB活性的途径抑制UC的炎症反应，从而达到治疗UC的目的，目前尚无研究。
本课题中我们应用葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)诱导的BALB/C小鼠建立UC动物模型，研究乌司他丁在UC中对NF-κB的抑制作用，及通过此途径治疗UC的价值。以此为基础应用于临床研究，扩展乌司他丁的应用范围, 开发新的用于UC的药物。
1 材料与方法
1.1 实验动物 选取健康雄性BALB/C小鼠32只，8周龄，体质量20～25 g，由哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供。小鼠常规饲养,保证环境清洁，通风良好，湿温度适宜(温度24～25 ℃，湿度70%～75%，照明方案12 L/12 D)。此方案经哈尔滨医科大学动物保护与应用委员会批准。
1.2 主要药物和试剂 DSS(M.W.=36 000～50 000，上海翊圣生物科技有限公司)；MPO测定试剂盒、SOD测定试剂盒、ELISA试剂盒(北京义翘神州生物科技有限公司)；其他试剂为进口或国产分析纯。
1.3 动物模型的建立及分组处理 从32只小鼠中随机抽取24只禁食不禁水24 h后称重，自由饮用3%DSS溶液7 d建立小鼠急性UC模型。造模后24 h随机分3组，每组8只，模型对照组：每日生理盐水0.1 ml 灌胃，生理盐水0.1 ml腹腔注射；柳氮磺吡啶治疗组：每日浓度为50 mg/ml的柳氮磺吡啶0.1 ml灌胃，生理盐水0.1 ml腹腔注射；柳氮磺吡啶+乌司他丁治疗组：每日浓度为50 mg/ml浓度的柳氮磺吡啶0.1 ml灌胃，浓度为1 500 U/ml的乌司他丁0.1 ml腹腔注射。另外8只小鼠作为正常对照组，自由饮用清水7 d后，间隔24 h后开始每日生理盐水0.1 ml 灌胃，生理盐水0.1 ml腹腔注射。
1.4 测定相关指标
1.4.1 疾病活动指数(DAI)评分[5]：包括体质量下降情况、大便性状及便血情况，记录疾病活动指数(disease activity index，DAI)， 评分方法见表1。
表1 DAI评分标准
Tab 1 Scoring of DAI
计分体质量下降(%)大便性状便血0无正常阴性11～5--26～10半稀便潜血311～15--4>15稀便肉眼血便
注：正常大便为干燥成形且呈小粒状，半稀便为糊状但不黏肛门，稀便为液体状且黏肛门。
1.4.2 HE染色光镜下观察组织病理学改变：取病变明显处以多聚甲醛固定，24 h后进行漂洗，经 70%、80%、90%、95%、95%、100%、100%、100%酒精梯度逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后行4 μm 厚度切片，HE染色，用中性树脂封闭后，光镜下观察病理形态。具体评分标准见表2[6]。
表2 组织学损伤评分标准
Tab 2 Scoring of hisopathology damage
组织学表现评分溃疡(mm)无溃疡0小溃疡<31大溃疡>32炎症轻度1重度2肉牙肿无0有1病变深度无0黏膜下层1肌层2浆膜层3纤维化无0轻度1重度2
1.4.3 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性测定： 取中段结肠,冰1×PBS 冲洗,冻存于液氮;测定时从液氮中取出结肠组织,称重,剪碎,以冰生理盐水作匀浆介质,玻璃匀浆器冰上匀浆成10%匀浆液,其它操作步骤根据试剂盒要求,作相应处理后测定吸光度,计算相应的SOD活性。
1.4.4 免疫组化方法测定小鼠结肠黏膜 NF-κB的表达：免疫组化采用半定量积分法计算免疫组化学染色积分：阳性细胞率：每张切片检测5个视野(400倍)，所见的阳性细胞分为0～4级;染色强度：显微镜下观察，仅细胞核着蓝色者为阴性，细胞浆或核膜上呈棕黄色为阳性。强度分0～3级。
1.4.5 ELISA法测定TNF-α、白蛋白、C反应蛋白的表达：摘眼球取血，将血液静置后离心(3 500 r/min)10 min取血清，分装后置-20 ℃冰箱保存，实验结束后，严格按照试剂盒说明书统一测定 TNF-α、白蛋白、C反应蛋白含量。计算：绘制标准曲线，横坐标是标准物的浓度，纵坐标是OD值。根据样品的OD值由坐标曲线查出相应的浓度，然后乘以稀释倍数。
2 结果
2.1 DAI评分结果 小鼠于造模开始第3天逐渐出现精神萎靡、毛发直立、肉眼血便，第5天出现血便，至第7天均出现肉眼血便或便潜血阳性，严重者在出现肉眼纯稀血便的同时肛周黏附少量血液。造模7 d后小鼠体质量下降明显，均超过原体质量的15%，均出现肉眼血便。给予柳氮磺吡啶治疗后，小鼠血便逐渐减少、质地变干，体质量逐渐升高，而加用乌司他丁组则好转更为明显。至第7天，柳氮磺吡啶+乌司他丁治疗组小鼠大多排半稀便，个别便潜血阳性，体质量减轻多为5%以内，DAI评分为3.750+0.707，柳氮磺吡啶治疗组大部分小鼠仍半稀便，但多为便潜血阳性甚至可见肉眼血便，体质量下降6%～10%，DAI评分为5.250+0.886；正常对照组表现均正常，DAI评分为0。而模型对照组小鼠一般状态极差，仍持续血便，体质量下降明显，DAI评分为9.625+0.916；4组之间采用SNK-q检验，且各组间差异均具有统计学意义(F=238.647，P<0.001)。
2.2 白蛋白、C反应蛋白检测结果 白蛋白：正常对照组(26.200±0.532)>乌司他丁+柳氮磺吡啶治疗组(19.050±0.359)>柳氮磺吡啶组(16.138±0.169)>模型对照组(15.100±0.307)，且各组间差异均具有统计学意义(F=1501.561，P<0.001)。
C反应蛋白：正常对照组(0.856±0.022)<乌司他丁+柳氮磺吡啶组(1.188±0.087)<柳氮磺吡啶组(1.513±0.023)<模型对照组(1.846±0.045)，且各组间比较差异均具有统计学意义(F=547.200，P<0.001)。
2.3 组织病理学改变 对照组病理检查显示正常结构和病变组织无异常变化(见图1A)。模型对照组黏膜损伤明显，结构破坏，明显的上皮细胞崩解，炎性细胞浸润、水肿和隐窝脓肿形成(见图1B)。柳氮磺吡啶治疗组炎症反应明显降低(见图1C)，加用乌司他丁组炎症减轻更为明显，组织学评分显著下降(见图1D)。HE评分正常对照组(0)<乌司他丁+柳氮磺吡啶组(3.000±0.535)<柳氮磺吡啶治疗组(4.125±0.641)<模型对照组(7.875±0.641)。
2.4 SOD测定结果 乌司他丁+柳氮磺吡啶组较柳氮磺吡啶组SOD指标明显升高(见图1、表3)。
图1 各组组织病理学改变(HE 100×) A:正常对照组;B:模型对照组;C:柳氮磺吡啶治疗组;D:柳氮磺吡啶+乌司他丁组
Fig 1 Histological changes in each group(HE 100×) A:normal control group;B:model control growp;C:Sulfasazine treatment group;D:Sulfasalazine combined with Ulinastatin treatment group
表3 各处理组SOD 值比较
Tab 3 Comparison of SOD value in each treatment group
分组α=0．05的子集只数1234模型对照组844．3750柳氮磺吡啶组865．6250乌司他丁+柳氮磺吡啶组873．8750正常对照组882．6250显著性1．0001．0001．0001．000
2.5 免疫组化方法测定小鼠结肠黏膜NF-κB的表达 免疫组化评分正常对照组(1.450±0.141)；模型对照组(5.375±0.292)；柳氮磺吡啶治疗组(3.700±0.151)；乌司他丁+柳氮磺吡啶组(2.575±0.128)，各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。
2.6 ELISA法检测TNF-α的表达 SNK-q检验F=2559.967，P<0.001，各组间比较见下表(见表4)。
图2 各组小鼠结肠黏膜NF-κB的表达情况(HE 200×) A:正常对照组;B:模型对照组;C:柳氮磺吡啶治疗组;D:柳氮磺吡啶+乌司他丁治疗组
Fig 2 The NF-κB expression of colonic mucosa in each group (HE 200×) A:normal control group;B:model control group;C:Sulfasalazine grap;D:Sulfasalazine combined with Ulinastatin treatment group
表4 各处理组TNF-α数值的比较(μg/L)
Tab 4 Comparison of TNF-α value in each treatment group(μg/L)
剂量α=0．05的子集只数1234模型对照组836．2500柳氮磺吡啶组893．3750乌司他丁+柳氮磺吡啶组8123．5000正常对照组8134．3750显著性1．0001．0001．0001．000
3 讨论
IBD是一种临床常见疾病，具有病程长、病情迁延不愈、反复发作等特点，传统治疗方式如5-氨基水杨酸制剂及其衍生物、免疫抑制剂、糖皮质激素等，能控制部分患者的症状，但疗效并不尽如人意，且存在药物依赖、副作用大等问题[7-8]。近年来生物治疗已由实验研究逐步转向临床应用。如抗TNF单克隆抗体Infliximab(英夫利昔)对IBD的疗效和安全性已获得肯定，但治疗过程中存在感染、输液反应、迟发型过敏反应、自身抗体及药物性红斑狼疮等不良反应[9]。因此，基于IBD的发病机制，开发研制治疗IBD疗效确切且安全可靠的药物仍是现阶段面临的主要问题。
核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)是一种具有多向转录调节作用的蛋白质， 广泛存在于真核细胞中，参与许多疾病的发病机制。正常状态下，核转录因子NF-κB家族成员通常以二聚体形式与其抑制蛋白IκB形成复合物，以非活性形式存在于细胞质中。只有在受到各种活化因素的作用，IκB蛋白激酶IKK活化，IκB被磷酸化并通过26S 蛋白酶体顺序降解，与NF-κB解离，NF-κB活化进入细胞核内，其DNA结合位点暴露，与DNA启动子上特定的认知序列结合，调控NF-κB反应性基因的转录。在IBD中，活化的NF-κB可调节与IBD发生、发展相关的促炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)等的产生和释放，加重肠道的炎性反应。由此提示NF-κB的激活在调节免疫及炎性反应中起着关键作用，抑制NF-κB的活性可以起到治疗IBD的作用。寻找靶向抑制NF-κB活性的方法用于IBD治疗，此方面的研究具有非常重大的科学意义和社会价值，从新药开发的角度也具有较高的经济价值。这也是本课题的研究重点。
乌司他丁是临床上应用非常广泛的药物。作为蛋白酶抑制剂,能够对透明质酸酶、胰蛋白酶、缓激肚、弹力蛋白酶等多种蛋白分解酶,同时能够有效抑制脂肪、磷脂酶AZ等脂肪分解酶,同时可维持溶酶体膜、细胞膜,对溶酶体酶释放及活性,从而在水解酶外溢、细胞溶酶体膜破裂、功能亢进等导致的疾病如失血性休克、急性胰腺炎等疾病中使用,同时可对肿瘤转移及侵袭进行抑制。也有研究[10]表明，乌司他丁可以通过抑制NF-κB活性的途径减轻肝缺血再灌注后的损伤程度。
本实验通过经典的DSS法成功建立了UC小鼠模型，通过观察小鼠一般状态记录DAI、HE染色记录组织学损伤指数、血液化验C反应蛋白及ALB、SOD活性测定几个水平检测乌司他丁对UC模型小鼠的治疗效果，可见明显优于单纯使用传统药物柳氮磺吡啶组。免疫组化检测NF-κB p65的表达，可见应用乌司他丁组较单纯应用柳氮磺吡啶组更明显抑制NF-κB的表达，分析乌司他丁对NF-κB活性的抑制可能与乌司他丁作为蛋白酶抑制剂抑制了26S蛋白酶的活性从而抑制了IκB降解，NF-κB与IκB无法解离，从而处于非活性状态有关。NF-κB的抑制也减轻了TNF-α的产生和释放，进一步抑制了炎症反应，从而达到治疗的目的。本实验为乌司他丁用于IBD的治疗提供了理论依据，而乌司他丁作为临床上应用广泛的药物，其安全性和有效性也已得到证实。在临床中将乌司他丁用于IBD的治疗对开拓药物的应用领域，提高患者的治疗效果起到重要的作用，也是我们今后临床研究的方向。
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Research on the inhibition effect and mechanism of Ulinastatin on mice model with ulcerative colitis
HU Lihong, LI Qing, QU Bo
Department of Gastroenterology, the 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, China
Objective To explore whether Ulinastatin can inhibit the NF-κB activity and can exert effect on the treatment of ulcerative colitis (UC).Methods Twenty-four BALB/C mice were used to establish UC mice model in the method of DSS. After modeling, the mice were randomly divided into 3 groups, the model control group, Sulfasalazine treatment group, Sulfasalazine combined with Ulinastatin treatment group, and normal control group were arranged to drink distilled water. Seven days after treatment, relevant parameters of mice were measured: disease activity index (DAI), changes of colon histopathology, expressions of ALB, CRP and TNF-α in serum， the expressions of SOD and NF-κB in colonic mucosa. Results Comparison of activity index, CRP, TNF-α and NF-κB of mice in each group after treatment: there were the normal control group
Ulinastatin; Mice; Ulcerative colitis; NF-κB; Treatment
黑龙江省卫生计生委科研课题(2014-332)
胡丽红，主治医师，硕士，研究方向：溃疡性结肠炎发病机制的研究。E-mail:hlh902@163.com
10.3969/j.issn.1006-5709.2016.10.009
R574.62
A
1006-5709(2016)10-1111-05
2016-06-17
