张夏璐，李冶夫，周 平

1.北京空军总医院消化内科，北京 100142； 2. 哈佛大学医学院医学系，美国马萨诸塞州波士顿

肠道炎症在早期骨关节炎模型小鼠中的表现

张夏璐1,2，李冶夫2，周 平1

1.北京空军总医院消化内科，北京 100142； 2. 哈佛大学医学院医学系，美国马萨诸塞州波士顿

目的 研究小鼠早期骨关节炎(osteoarthritis,OA)与肠道炎症的关系，为炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)相关的OA的治疗提供新的思路。方法 使用Ⅸ型胶原蛋白部分缺失的自发性OA模型小鼠。基因型分型后，将cho/+小鼠作为实验组，其同窝出生的野生型+/+小鼠作为对照组。使用零假设理论，假设“小鼠早期OA与肠道炎症病变的发生无关”，在小鼠3个月大时参考疾病活动指数(DAI)的内容对其进行临床表现方面的观察；收集肠道组织，参考结肠黏膜损伤指数(CMDI)进行大体病理学观察，并将肠道标本进行组织病理学处理后，进行镜下观察。结果 实验组与对照组在临床表现和组织病理学方面差异无统计学意义。结论 接受零假设，即小鼠OA在早期与肠道炎症的发生无关，也证明早期OA不会诱发IBD的发生。

炎症性肠病；溃疡性结肠炎；克罗恩病；骨关节炎；零假设

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种以肠道严重的炎症及黏膜破坏为特征的慢性复发性疾病，包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，目前尚无明确病因。IBD有多种临床表现，包括消化道症状、全身症状及肠外表现(extraintestinal manifestations，EIMs)。现已报道的EIMs的发病率范围为6%～47%[1]，其中骨关节炎(osteoarthritis，OA)发病率最高，在成人IBD患者中达到40%[1]，在儿童IBD患者中为25%[2]。OA虽病因不明，但因软骨和骨骼的破坏最终导致患者出现关节疼痛、僵硬和功能丧失等临床表现[3]，给患者的日常生活带来很多痛苦，也增加了IBD治疗的复杂性。现阶段，EIMs的发病机理尚不完全清楚，但有研究表明细菌可以通过胃肠道黏膜引发肠道外部位的免疫反应[4-5]。但尚无明确的研究表明IBD的EIMs，如OA是否可引发IBD或加重IBD的病情。

2003年，Xu等[6-7]对软骨发育不全(chondrodysplasia，cho)小鼠(即基因编码Ⅸ型胶原的α1链(Col11a1)时发生功能缺失性突变)进行报道，证实其杂合子小鼠(cho/+)出现OA病变；与杂合子小鼠同窝的纯合子小鼠(cho/cho)出生即死亡；野生型小鼠(+/+)作为对照组，最后证实不出现关节软骨退化等OA特征。同时，Xu等[7]在文章中指出，从3个月开始，杂合子小鼠即在膝关节及下颌骨关节表现出OA的特征改变。

在本次研究中，我们选择上述OA小鼠模型，观察其临床症状，并对肠道组织进行组织病理学研究，在零假设的理论基础上，对OA小鼠模型进行肠道炎症表现的探索。

1 材料与方法

1.1 材料 根据前文所述软骨发育不全小鼠的基因特点[6]，选择杂合子cho/+小鼠和野生型+/+小鼠进行研究。所有小鼠均在哈佛医学院动物实验中心进行交配和饲养，室温为恒温25 ℃，保持12 h灯光照明及12 h黑暗，小鼠自由进食颗粒饲料及自来水。所有方案均符合哈佛医学院实验动物管理与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committees，IACUC)的要求。

1.2 方法

1.2.1 基因型分型：在小鼠生长到3周时通过打耳洞的方式对其进行编号，同时剪取一段长约3 mm的尾巴并从中提取DNA。随后进行PCR，获得含有528个碱基对的DNA片段。在PCR中所使用的正向引物为：5′-GGTGTTGTCCTGGGTAAACAG-3′；反向引物为：5′-GCAGTCACCATTGTCTAATCATC-3′。将PCR产物根据QIAGEN试剂盒法纯化后，进行DNA测序，所使用引物为：5′-AGCTAAGCCACTGAGGCACAA-3′。最后根据测序结果进行基因型分型。

1.2.2 实验分组：在已明确基因型分型的小鼠中随机抽取3个月大的4只cho/+小鼠作为实验组，4只野生型+/+小鼠为对照组，且每组为2只雌鼠和2只雄鼠。

1.3 观察指标

1.3.1 临床症状观察：观察其精神状态，进食、活动及皮毛状况，并参考疾病活动指数(disease activity index，DAI)中的观察指标：体质量、大便性状[8]。具体于实验终止期前1周每日观察其精神、进食情况及大便性状等，并于终止期进行体质量测量。

1.3.2 大体病理学观察：实验终止期收集肠道组织:末端回肠、结肠、直肠[9-10]。此参考结肠黏膜损伤指数(colonic mucosa damage index，CMDI)对结肠组织进行肉眼观察，包括肠道有无粘连，有无充血、溃疡或肠壁增厚等[11]。

1.3.3 组织病理学观察：将肠道标本进行组织固定、乙醇梯度脱水及石蜡包埋。为更全面地观察组织病理变化，我们将每一个肠道组织进行横切面及纵切面两种包埋方式。组织切片时，每个蜡块均做组织最大切面的多个连续切片(10～14片)，每一个切片厚度为6 μm。HE染色后，采用双盲法在光学显微镜下进行观察。

2 结果

2.1 临床症状 实验终止期前1周对实验组及对照组小鼠进行前述临床症状观察时发现，cho/+小鼠及+/+小鼠在精神状态、进食、活动及皮毛状况上无明显差异，进食、活动均正常，精神佳，毛色光泽，大便性状正常。无精神萎靡、少动、进食减少、腹泻、血便等症状。实验终止期，分别对其进行体质量测量，实验组小鼠体质量较对照组无明显差异，未出现体质量减轻情况。2.2 大体病理学观察 处死小鼠后，解剖实验组小鼠时，未发现结肠与周围组织粘连，近端肠腔无扩张，未发现肠腔局部充血水肿，肠壁无溃疡且未增厚。即所有参考CMDI的观察指标，实验组及对照组均无显著性差异。

2.3 组织病理学观察 镜下观察组织切片时，实验组及对照组均未发现炎症异常表现，可见清晰的黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层，且无充血水肿、无炎性细胞浸润;隐窝结构正常，无扭曲或脓肿；细胞形态正常，且无杯状细胞减少等(见图1)。肠道黏膜层在肠道免疫系统中起到重要作用，小鼠的结肠黏膜层各组织结构清晰，无非典型增生和肉芽组织形成；上皮细胞及杯状细胞排列规则(图中如花朵状)，无中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润和淋巴滤泡形成。花朵状结构周围的固有层结缔组织正常，无炎性细胞及淋巴细胞浸润(见图2)。其中派伊尔结(Peyer’s patches，PP)是小肠的黏膜滤泡组织，为肠道相关淋巴样组织的重要组成部分。其在实验组及对照组中也无明显数量上的差异，且边界清晰，T细胞、B细胞及M细胞无异常增多(见图3)。

图2 结肠黏膜层纵切面高倍光镜下表现(400×) A：实验组；B：对照组

Fig 2 Expression of longitudinal section of colonic mucosa under lighe microscopic(400×) A: experimental group;B: control group

图3 小肠纵切面派伊尔结光镜下表现(100×) A：实验组；B：对照组

Fig 3 Expression of longitudinal section of PPs in small intestines under light microscopic(100×) A: experimental group;B: control group

3 讨论

随着Fisher对现代统计学的建立，其与Neyman、Pearson等先后提出很多重要的理论方法为统计学做出了重大贡献。其中“零假设”(null hypothesis)这一理论概念的提出，在科学界受到广泛赞扬，成为客观数据分析的必要条件[12-13]。在本实验中，我们使用了零假设的理论，即假设“小鼠早期OA与肠道炎症病变的发生无关”。这为本次实验研究的进行奠定了严肃客观的基石。

近年来，IBD的发病率正在逐年上升。有研究显示，UC每年在欧洲居民中的发病率为19.2/100 000～24.3/100 000，在亚洲和中东国家居民的发病率为6.3/100 000；CD每年在欧洲和美国的发病率为12.7/100 000～20.2/100 000，在亚洲和中东的发病率为5/100 000[14]。又因为IBD病因不明、病情迁延不愈，使IBD成为消化系统疾病中一个亟待解决的难题。同时因其伴随复杂多样的肠外表现，又加重了IBD治疗的复杂性。在此现状基础上我们发现，在IBD患者的肠外表现中，最多发且严重影响患者生活质量的疾病为OA。它是一种滑膜关节的进行性疾病，表现为滑膜关节组织异常使得重力导致的关节损害不能正常修复。由于IBD是自身免疫系统紊乱引起免疫系统过度反应而导致临床症状出现的疾病，同时OA也是一种炎症性疾病，所以我们将OA和IBD的肠道炎症表现作为实验研究的两个方面，如前文所述，假设“小鼠早期OA与肠道炎症病变的发生无关”。在此基础上对OA小鼠模型进行深入实验研究，结果或可对IBD的治疗起到参考作用。

1971年，Seegmiller等[15]发现小鼠常染色体隐性的cho基因突变引起四肢、肋骨、下颌骨和气管的软骨发育障碍，导致骨骼缺陷。1995年Li等[6]发现其突变位点并揭开了其中的奥秘：cho基因与编码Ⅺ型胶原α1链(Col11a1)的基因在3号染色体的同一位点，在此位点的mRNA上缺失了翻译启动密码子下游第570个核苷酸位点的胞嘧啶，使阅读框架发生改变，最终导致了终止密码子的提前出现。在此基础上，Xu等[7]在2003年对cho/+基因小鼠的膝关节及下颌骨关节进行研究时又发现，其软骨形态学、胶原纤维状态、MMP-3和MMP-13蛋白表达水平及生物力学等变化特征均与人类OA发展过程相似。又由于早在上世纪90年代就有研究证明单基因突变或为OA的诱发因素：基因编码Ⅱ型胶原(Col 2a1)、Ⅸ 型胶原(Col 9a1、Col 9a2、Col 9a3)、Ⅺ型胶原(Col11a1、Col11a2)时发生突变，与人类软骨发育不全的早发型OA密切相关[16-20]。所以，cho基因小鼠无论是在基因突变类型还是OA发展进程中，都与人类OA高度相符，成为世界上最早且最符合人类OA特征的小鼠模型。

EIMs在IBD中有很高的发病率，同一种EIMs的复发很常见，且患一种EIMs后出现其他种类EIMs的风险也明显增高[21]。OA是IBD患者中最常见的EIMs，在CD患者中的发病率的是UC的2倍(20%：11%)[22]，男性和女性的患病风险基本相同[23]。IBD患者中的OA分为外周关节炎和脊柱关节炎两大类，外周关节炎又分两种类型：I型(少关节型)和Ⅱ型(多关节型)[24]。现阶段对IBD相关性OA的治疗以减少炎症和防止残疾及畸形为目的[25]，Ⅰ型外周关节炎与IBD的活动性相关，所以使用药物和手术积极治疗原发IBD就可以有效控制关节炎病情。研究[21]表明，在成功治疗IBD之后的8～10周，OA症状可消失，且无关节损害和畸形[23]。Ⅱ型外周关节炎与IBD的活动性无关，病情可持续数月或数年[24]，其治疗相对困难和复杂。由于肠道症状治疗对OA无效，所以以物理疗法和止痛治疗为主[1]。脊柱关节炎在IBD患者中的发病率为3%～5%[26-27]，男性较女性高发[23]。也分两种类型：强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)和骶髂关节炎，均与IBD活动性无关。IBD相关的AS治疗完全依据无IBD的单纯AS治疗方案：物理治疗被用来保持脊柱灵活性和防止脊柱畸形；运动方案包括深呼吸、脊柱运动和游泳[28]。骶髂关节炎通常无症状[29]，无特殊治疗方案，以物理治疗为主。除此之外，非甾体类抗炎药(NSAIDs)、抗肿瘤坏死因子(anti-TNF)、柳氮磺吡啶、类固醇类等药物广泛应用于IBD相关的OA治疗中，但因药物自身的副作用及病情的复杂性，使药物在IBD相关OA中的应用更为谨慎和多样化[1,21,25,29]。临床数据表明，在使用生物药物时，我们需根据不同类型及不同严重程度的OA制定不同的治疗方案[30]。

在本实验研究中，我们从OA模型小鼠入手，深入探讨OA与肠道炎症的关系，或可为复杂的临床治疗开辟新的思路。研究结果显示3个月时，实验组小鼠在临床症状及组织病理学方面与对照组比较无显著性差异。这一结果使我们在接受零假设的同时，也证明了OA在早期不引起肠道炎症发生，不会诱发IBD出现。由于接受零假设仅代表此次实验样本的结果，并不能说明没有倾向，所以可继续进行中期和晚期OA与肠道炎症发生的关系研究，以进一步完整探索OA在发生、发展、形成的全过程中与肠道炎症的关系。其结果可对IBD与OA的关系及IBD相关OA的治疗提供更全面的动物实验依据。

[1]Vavricka SR, Schoepfer A, Scharl M, et al. Extraintestinal manifestations of inflammatory bowel disease [J]. Inflamm Bowel Dis, 2015, 21(8): 1982-1992.

[2]Cardile S, Romano C. Current issues in pediatric inflammatory bowel disease-associated arthropathies [J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(1): 45-52.

[3]Lane NE, Brandt K, Hawker G, et al. OARSI-FDA initiative: defining the disease state of osteoarthritis [J]. Osteoarthritis Cartilage, 2011, 19(5): 478-482.

[4]Biancone L, Mandal A, Yang H, et al. Production of immunoglobulin G and G1 antibodies to cytoskeletal protein by lamina propria cells in ulcerative colitis [J]. Gastroenterology, 1995, 109(1): 3-12.

[5]Das KM, Vecchi M, Sakamaki S. A shared and unique epitope(s) on human colon, skin, and biliary epithelium detected by a monoclonal antibody [J]. Gastroenterology, 1990, 98(2): 464-469.

[6]Li Y, Lacerda DA, Warman ML, et al. A fibrillar collagen gene, Col11a1, is essential for skeletal morphogenesis [J]. Cell, 1995, 80(3): 423-430.

[7]Xu L, Flahiff CM, Waldman BA, et al. Osteoarthritis-like changes and decreased mechanical function of articular cartilage in the joints of mice with the chondrodysplasia gene (cho) [J]. Arthritis Rheum, 2003, 48(9): 2509-2518.

[8]Ganta VC, Cromer W, Mills GL, et al. Angiopoietin-2 in experimental colitis [J]. Inflamm Bowel Dis, 2010, 16(6): 1029-1039.

[9]Hagen JW, Swoger JM, Grandinetti LM. Cutaneous manifestations of crohn disease [J]. Dermatol Clin, 2015, 33(3): 417-431.

[10]Dai YC, Zhang YL, Wang LJ, et al. Clinical presentation and treatment strategies for ulcerative colitis: A retrospective study of 247 inpatients [J]. Chin J Integr Med, 2015 Oct 26. [Epub ahead of print].

[11]Wallace JL, Keenan CM, Gale D, et al. Exacerbation of experimental colitis by nonsteroidal anti-inflammatory drugs is not related to elevated leukotriene B4 synthesis [J]. Gastroenterology, 1992, 102(1): 18-27.

[12]Nicolas A, Rossignol JL. Null hypothesize and prediction [J]. Nature, 1985, 314(6008): 230.

[13]Edwards W. Science, statistics and society [J]. Nature, 1971, 233(5314): 17-19.

[14]Gómez-Gómez GJ, Masedo, Yela C, et al. Current stage in inflammatory bowel disease: What is next[J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(40): 11282-11303.

[15]Seegmiller R, Fraser FC, Sheldon H. A new chondrodystrophic mutant in mice. Electron microscopy of normal and abnormal chondrogenesis [J]. J Cell Biol, 1971, 48(3): 580-593.

[16]Spranger J, Winterpacht A, Zabel B. The type-II collagenopathies: a spectrum of chondrodysplasias [J]. Eur J Pediatr, 1994, 154(2): 56-65.

[17]Moraga Y, Marian EC, van Beer sum SE, et al. A mutation in COL9A2 causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2)[J]. Ann N Y Acad Sci, 1996, 785: 303-306.

[18]Paassilta P, Lohiniva J, Annunen S, et al. COL9A3: a third locus for multiple epiphyseal dysplasia [J]. Am J Hum Genet, 1999, 64(4): 1036-1044.

[19]Czarny-Ratajczak M, Lohiniva J, Rogala P, et al. A mutation in COL9A1 causes multiple epiphyseal dysplasia: further evidence for locus heterogeneity [J]. Am J Hum Genet, 2001, 69(5): 969-980.

[20]Bruckner P, van der Rest M. Structure and function of cartilage collagens [J]. Microsc Res Tech, 1994, 28(5): 378-384.

[21]Lakatos PL, Lakatos L, Kiss LS, et al. Treatment of extraintestinal manifestations in inflammatory bowel disease [J]. Digestion, 2012, 86 Suppl 1: 28-35.

[22]Veloso FT, Carvalho J, Magro F. Immune-related systemic manifestations of inflammatory bowel disease. A prospective study of 792 patients [J]. J Clin Gastroenterol, 1996, 23(1): 29-34.

[23]Rothfuss KS, Stange EF, Herrlinger KR. Extraintestinal manifestations and complications in inflammatory bowel diseases [J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(30): 4819-4831.

[24]Orchard TR, Wordsworth BP, Jewell DP. Peripheral arthropathies in inflammatory bowel disease: their articular distribution and natural history [J]. Gut, 1998, 42(3): 387-391.

[25]Peluso R, Manguso F, Vitiello M, et al. Management of arthropathy in inflammatory bowel diseases [J]. Ther Adv Chronic Dis, 2015, 6(2): 65-77.

[26]Su CG, Judge TA, Lichtenstein GR. Extraintestinal manifestations of inflammatory bowel disease [J]. Gastroenterol Clin North Am， 2002, 31(1): 307-327.

[27]Fornaciari G, Salvarani C, Beltrami M, et al. Muscoloskeletal manifestations in inflammatory bowel disease [J]. Can J Gastroenterol, 2001, 15(6): 399-403 .

[28]Williams H, Walker D, Orchard TR. Extraintestinal man- ifestations of inflammatory bowel disease [J]. Curr Gastroenterol Rep, 2008, 10(6): 597-605.

[29]Trikudanathan G, Venkatesh PG, Navaneethan U. Diagnosis and therapeutic management of extra-intestinal manifestations of inflammatory bowel disease [J]. Drugs, 2012, 72(18): 2333-2349.

[30]Veloso FT. Extraintestinal manifestations of inflammatory bowel disease: do they influence treatment and outcome [J]. World J Gastroenterol, 2011, 17(22): 2702-2207.

(责任编辑：马 军)

Manifestation of intestinal inflammation at early stages of osteoarthritis in model mice

ZHANG Xialu1,2, LI Yefu2, ZHOU Ping1

1. Department of Gastroenterology, Air Force General Hospital, PLA, Beijing 100142，China; 2.Faculty of Medicine, Harvard Medical School, Boston

Objective To investigate the relationship between early osteoarthritis (OA) and intestinal inflammation in model mice, thus provide novel insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease(IBD) associated with OA.Methods A spontaneous mouse model of OA, type Ⅺ collagen-haploinsufficiency (chondrodysplasia, cho) in mice was used in this study. After genotyping, cho/+ mice were used as the experimental group, while their wild-type littermates were as the control group. The null hypothesis, which was no significant relationship between early OA and inflammation of intestines, was applied in this investigation. The intestine of mice at the age of 3 months old was collected and evaluated according to disease activity index(DAI). The tissues were also assessed for the pathological analysis based on colonic mucosa damage index(CMDI).Results The clinical manifestations and histopathology were no singnificant difference between the exeperimental group and control group. Conclusion The early OA is not related to the onset of intestinal inflammation in mice and the IBD is not exacerbated at the early stage of OA in mice.

Inflammatory bowel disease; Ulcerative colitis; Crohn’s disease; Osteoarthritis; Null hypothesis

周平，主任医师，博士，研究方向：消化系统常见疾病及消化系统肿瘤。E-mail：zhouping4946@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.10.011

R574.62

A

1006-5709(2016)10-1120-04

2015-12-19