范博涵 杨晓勇 钱小松 张希诺 刘航 王玮 胡小鹏 张小东



·论著·

血清B细胞刺激因子及C3d结合型供者特异性抗体在肾移植术后慢性抗体介导排斥反应中的诊断价值

范博涵 杨晓勇 钱小松 张希诺 刘航 王玮 胡小鹏 张小东

目的 观察血清B细胞刺激因子(BAFF)与C3d结合型供者特异性抗体(DSA)在肾移植术后慢性抗体介导排斥反应(AMR)中的诊断价值。方法 回顾性分析2010年5月至2012年5月于首都医科大学附属北京朝阳医院行同种异体肾移植术的109例受者资料，观察术后3年慢性AMR发生情况。病理诊断为慢性AMR的患者，留取诊断时刻静脉血5 mL；同时留取与慢性AMR患者同期行肾移植术、未发生慢性AMR的受者血样。检测血清BAFF值、群体反应性抗体(PRA)和DSA，PRA强阳性和DSA阳性者检测血清C3d结合型DSA。绘制BAFF和C3d结合型DSA受试者工作特征(ROC)曲线，计算灵敏度、特异度、约登指数及曲线下面积。P<0.05为差异有统计学意义。结果 109例肾移植受者中，共19例病理诊断为慢性AMR，血样平均留取时间为术后(28±7)个月，同期手术且未出现慢性AMR的32例受者血样留取时间为术后(27±5)个月。慢性AMR患者和同期手术的非慢性AMR患者DSA阳性比例、C3d结合型DSA阳性比例和BAFF值分别为52.6%(10/19)和15.6%(5/32)、26.3%(5/19)和3.1%(1/32)、(2 070±825)pg/mL和(790±293)pg/mL，差异均有统计学意义(χ2=43.59、6.18，t=23.745，P均<0.05)，PRA阳性比例两组差异无统计学意义。血清BAFF和C3d结合型DSA诊断慢性AMR的灵敏度、特异度、约登指数和ROC曲线下面积分别为83%和77%、79%和83%、0.62和0.60、0.78和0.79，ROC曲线下面积差异无统计学意义(P>0.05)。结论 血清BAFF和C3d结合型DSA对诊断肾移植术后慢性AMR有一定价值，可作为高危患者诊断慢性AMR的辅助手段。

肾移植； B细胞刺激因子； C3d； 供者特异性抗体； 抗体介导排斥反应

肾移植已经成为终末期肾病患者的重要治疗方式[1]，这得益于对排斥反应更好的控制、手术技术的提高、临床管理以及对术后感染、肿瘤、心血管疾病等并发症治疗方法的改善。慢性抗体介导排斥反应(antibody mediated rejection，AMR)仍然是移植物远期存活的最大障碍[2]。预测慢性AMR的生物标记对其早期诊断和治疗显得尤为重要。

有证据表明，B细胞在移植排斥反应的发生发展过程中可能发挥重要的作用。B细胞活化因子(B cell activating factor，BAFF)是一种对B细胞生成、成熟以及活化具有重要作用的同型三聚体。急性实体移植器官衰竭患者的免疫组织化学标本中可以看到与C4d相伴随出现的BAFF沉积[3]；在发生慢性排斥反应的移植肾中，也可以看到BAFF信使RNA以及蛋白表达升高[4]。Banham等[5]研究发现，在ABO血型不相容肾移植受者中，血清BAFF升高与AMR明显相关，BAFF可能可以预测AMR的发生风险；同时，中和AMR患者体内BAFF可能成为值得探索的治疗方法。

C3d是补体C3经过经典途径、旁路途经或甘露糖结合凝集素途经活化裂解而来的最小片段，是补体活化的标志，是连接天然免疫和获得性免疫的重要蛋白质分子。目前，已有一些研究将免疫组织化学C3d染色应用于移植肾、心脏等体液排斥反应的检测[6-7]。本研究旨在观察血清BAFF和C3d在慢性AMR中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2010年5月至2012年5月因终末期肾病于首都医科大学附属北京朝阳医院泌尿外科行同种异体肾移植的109例受者资料。男性72例，女性37例；平均年龄(42±11)岁(22～69岁)。原发病包括：慢性肾小球肾炎77例，糖尿病肾病9例，高血压肾病2例，多囊肾11例，IgA肾病9例，外伤1例。103例受者为首次移植，6例为再次移植。全部供、受者ABO血型相符，术前群体反应性抗体(panel reactive antibody，PRA)阴性，淋巴细胞毒交叉配合试验均为阴性。

109例受者术中均给予甲泼尼龙1 000 mg，术后500 mg/d连用3 d；术后采用环抱素/他克莫司+吗替麦考酚酯+醋酸泼尼松三联免疫抑制方案。他克莫司起始剂量为0.1 mg·kg-1·d-1，环孢素起始剂量为6.0 mg·kg-1·d-1，根据血药浓度调整用量；吗替麦考酚酯2 000 mg/d；醋酸泼尼松5～10 mg/d。出现病理诊断的急性排斥反应则予以抗胸腺细胞球蛋白治疗。

1.2 研究方法

所有受者均随访3年，观察慢性AMR发生情况。病理诊断为慢性AMR的患者，留取诊断时刻静脉血5 mL；同时留取与慢性AMR患者同期行肾移植术、未发生慢性AMR的受者血样，检测血清BAFF值、PRA和供者特异性抗体(donor specific antibody，DSA)，PRA强阳性及DSA阳性的患者同时检测血清C3d结合型DSA。术后3年内未出现慢性AMR的受者留取术后3年血样，检测血清BAFF值。

(1)血清BAFF值检测：采用ELISA法进行检测(美国R&D Systems公司试剂盒)，具体步骤参照试剂盒说明书进行，正常参考值为850 pg/mL[8]。

(2)PRA检测：采用LABScreen法(美国One Lambda公司)进行检测[9]。结果以平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)表示，MFI>1 000为阳性，>8 000为强阳性。

(3)DSA检测：采用Luminex®技术检测特异性抗体。HLA-Ⅰ类抗体包括HLA-A、B、Cw特异性抗体，HLA-Ⅱ类抗体包括HLA-DRB1、DQB1、DPB1特异性抗体。结果以MFI表示，MFI>1 000为阳性。

(4)C3d结合型DSA检测：采用Luminex®技术检测PRA强阳性(调整的MFI>8 000)及DSA阳性(调整的MFI>3 000)患者血清C3d结合型DSA。

1.3 统计学方法

2 结 果

109例受者移植术后3年血清肌酐中位数为121 μmol/L(65～341 μmol/L)，血红蛋白中位数为10.7 g/dL(7.7～14.7 g/dL)，平均血清BAFF值为(1 040±85)pg/mL。共19例患者病理诊断为慢性AMR，血样平均留取时间为术后(28±7)个月(14～36个月)，同期行肾移植但未出现慢性AMR的32例受者血样平均留取时间为术后(27±5)个月(16～36个月)。19例慢性AMR患者中，男性13例，女性6例，平均年龄(44±10)岁(28～58岁)；32例同期手术的非慢性AMR受者中，男性21例，女性11例，平均年龄(41±8)岁(23～55岁)。

共检出20例PRA强阳性，15例DSA阳性。慢性AMR患者和同期手术的非慢性AMR受者的DSA阳性比例、C3d结合型DSA阳性比例和BAFF值分别为52.6%(10/19)和15.6%(5/32)、26.3%(5/19)和3.1%(1/32)、(2 070±825)pg/mL 和(790±293)pg/mL，两组差异存在统计学意义(χ2=43.59、6.18，t=23.745，P均<0.05)；两组PRA阳性比例分别为52.6%(10/19)和31.2%(10/32)，差异无统计学意义(P>0.05)。

以病理诊断的慢性AMR为金标准，绘制ROC曲线。血清BAFF和C3d结合型DSA预测肾移植术后慢性AMR的诊断效能指标见表1。血清BAFF和C3d结合型DSA ROC曲线见图1，2。MedCalc软件比较BAFF和C3d结合型DSA ROC曲线下面积，发现差异无统计学意义(P>0.05)，二者诊断慢性AMR准确性均较高。

表1 血清BAFF和C3d结合型DSA预测肾移植术后慢性AMR的诊断效能指标

注： BAFF. B细胞活化因子；DSA. 供者特异性抗体；AMR. 抗体介导排斥反应

3 讨 论

BAFF是TNF家族成员，主要表达于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和活化的T细胞，有促进B细胞生成、存活以及成熟的作用[10-11]。在转基因小鼠模型中发现，提高BAFF表达可以提高B细胞活性及数量，同时增加血液中丙种球蛋白、致病性自身抗体水平以及狼疮样自身免疫疾病的发生率[12]。BAFF对移植物的负面影响主要通过3种BAFF受体起作用：激活剂和钙调亲环素配体相互作用分子、BAFF-R及B细胞成熟抗原，这些受体主要表达于包括浆细胞在内的B细胞谱系。在小鼠心脏移植模型中，BAFF缺乏的受体小鼠，尤其是同时应用CNI的受体小鼠存活时间更长[13]。小鼠胰岛移植模型中，BAFF被单克隆抗体阻滞后，可以观察到MHC不相容胰岛移植体存活[14]。在发生急性排斥反应的肾移植受者中，移植肾活检免疫组织化学检测可以看到BAFF伴随C4d在移植肾中沉积[3]。亦有长期随访研究发现，外周血BAFF阳性CD4 T细胞与移植肾失功相关[15]。提高BAFF信使RNA和蛋白表达增加了慢性排斥反应的发生风险[16]。

当异物进入机体时，在体内没有相应抗体的情况下，其自身及代谢产物，或非特异性免疫处理后的产物可以激活补体系统，补体激活的产物C3d与异物或抗原共价结合，通过CD21使B细胞参与免疫反应，起到连接固有免疫和适应性免疫的桥梁作用[17]。C3d的代谢速度慢，体内活化产生的C3d不会很快被清除，检测C3d对了解补体活性具有重要意义。在人体内，除小部分C3d与免疫复合物或抗原结合外，大部分游离在体液中，并进入血液循环，虽然其在尿液中因个体差异及肌酐清除率不同而有很大差别，但在正常人血清中C3d水平稳定[18]。研究显示，循环C3d结合型DSA的存在是诊断AMR时移植物丢失的独立预测因子[19]。

对于移植术后慢性AMR的早期诊断，目前还没有准确性较高的方法。PRA是各种组织器官移植术前筛选致敏受者的重要指标，与排斥反应、受者和移植物存活率密切相关[20]。而与PRA相比，DSA监测不仅能检测供者HLA特异性抗体，还能检测供者HLA交叉反应抗原的抗体，因此能更准确地反映受者体内致敏情况[21]。目前国内关于血清BAFF、C3d与移植术后AMR相关性的研究较少。移植术后移植物刺激机体产生各种免疫细胞，可能导致单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和活化的T细胞产生BAFF。这与Banham等[5]对肾移植术后血清BAFF的研究相似，该研究同样显示血清BAFF升高提示预后不良。国外诸多关于C3d的研究主要关注其在移植物中沉积的影响，结果显示移植肾C3d沉积提示预后不良[14,17]，但对血清游离C3d研究较少。本研究评估了血清BAFF、C3d结合型DSA水平对同种异体肾移植术后慢性AMR的诊断价值，结果显示血清BAFF及C3d结合型DSA诊断慢性AMR准确性均较高，二者无明显差别。但是，本研究C3d的检测是在DSA阳性或PRA强阳性的情况下进行，而血清BAFF的检测并不需要以PRA及DSA检测结果作为基础，故更为简便。

总之，血清BAFF、C3d结合型DSA检测对诊断肾移植术后慢性AMR有一定意义，对肾移植术后可能发生慢性AMR的受者可以考虑联合应用血清BAFF和C3d结合型DSA检测协助诊断。然而本研究病例数较少，且缺乏移植肾病理两种分子沉积的证据，故需要更多病例、更长随访时间的研究进一步证实结果。

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(本文编辑：鲍夏茜)

范博涵, 杨晓勇, 钱小松, 等. 血清B细胞刺激因子及C3d结合型供者特异性抗体在肾移植术后慢性抗体介导排斥反应中的诊断价值[J/CD]. 中华移植杂志: 电子版, 2016,10(4):165-168.

The value of serum B cell activating factor and C3d-binding donor specific antibody on diagnosis of chronic antibody mediated rejection after renal transplantation

FanBohan,YangXiaoyong,QianXiaosong,ZhangXinuo,LiuHang,WangWei,HuXiaopeng,ZhangXiaodong.

DepartmentofUrology,Chao-YangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,ChinaCorrespondingauthor:ZhangXiaodong,Email:zxd581@263.net

Objective To explore the value of serum B cell activating factor (BAFF) and C3d-binding donor specific antibody (DSA) on diagnosis of chronic antibody mediated rejection (CAMR) after renal transplantation. Methods The clinical data of 109 recipients who received renal transplantation in Beijing Chao-Yang Hospital during May 2010 to May 2012 was retrospectively analyzed. Incidence of CAMR in 3 years after renal transplantation was investigated. Once the recipients were diagnosed with CAMR, 5 mL of venous blood sample would be preserved, meanwhile, venous blood samples of recipients who recieved renal transplantation during the same period and without CAMR were also preserved. BAFF, panel reactive antibodies(PRA)and DSA were detected, furthermore, samples with strong positive PRA and DSA positive were detected with C3d-binding DSA. Then ROC curves with BAFF and C3d-binding DSA were analyzed. Results Ninteen cases among 109 recipients were diagnosed with CAMR. The venous blood samples of 19 recipients with CAMR and recipients who recieved renal transplantation during the same period and without CAMR were kept for (28±7) months and (27±5) months, respectively. Proportion of DSA and C3d-binding DSA positive and BAFF value of 19 recipients with CAMR and recipients who recieved renal transplantation during the same period and without chronic AMR were 52.6% vs 15.6%, 26.3% vs 3.1%, (2 070±825) pg/mL vs (790±293) pg/mL, respectively, which were all statically significant (χ2=43.59、6.18,t=23.745,Pall <0.05). The sensitivity, specificity, Youden index and area under the ROC curve of serum BAFF and C3d-binding DSA on diagnosis of CAMR were 83% vs 77%, 79% vs 83%, 0.62 vs 0.60 and 0.78 vs 0.79, respectively. There was no statistical difference on area under the ROC curve between the two groups (P>0.05). Conclusion Serum BAFF and C3d-binding DSA had certain value on diagnosis of CAMR, which could serve as a supplemental method for diagnosing CAMR in recipients at high risk.

Renal transplantation; B cell activating factor; C3d; Donor specific antibody; Antibody mediated rejection

10.3877/cma.j.issn.1674-3903.2016.04.004

北京市医院管理局临床医学发展专项经费(ZYLX201408)

100020 北京，首都医科大学附属北京朝阳医院泌尿外科

张小东，Email：zxd581@263.net

2016-04-25)