黄东辉，李广红，韩静静，侯丽君(泰山医学院临床学院，山东泰安7000；泰山医学院附属医院)



白花丹参水提物对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制探讨

黄东辉1，李广红2，韩静静1，侯丽君2(1泰山医学院临床学院，山东泰安271000；2泰山医学院附属医院)

摘要：目的 探讨白花丹参水提物对糖尿病(DM)大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法选择48只大鼠予高糖高脂饲养，经尾静脉注射链脲佐菌素35 mg/kg制备DM模型，随机分为DM组、LD组、HD组、WD组，每组各12只。另选择12只正常大鼠作为正常对照组(NC组)。造模成功后，LD组、HD组分别以白花丹参提取物15、30 g/(kg·d)灌胃，WD组以厄贝沙坦17.5 mg/(kg·d)灌胃，DM组以等剂量的生理盐水灌胃，均持续4周。NC组不灌胃。各组于造模后第4周末，末次给药后处死，取心肌组织，采用Western blot法检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相关X(Bax)蛋白、Bcl-2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(Bnip-3)的表达。结果DM组细胞凋亡明显，WD组、LD组细胞凋亡较DM组减轻，HD组心肌病理表现明显好于WD组和HD组。DM组Bcl-2蛋白表达低于其他各组，WD组、LD组Bcl-2蛋白表达均低于HD组(P均<0.01)。DM组Bax、Bnip-3蛋白表达均高于其他各组，WD组、LD组Bax、Bnip-3蛋白表达均高于HD组(P均<0.01)。结论白花丹参可减轻DM大鼠心肌细胞的凋亡，其机制可能与增加心肌组织Bcl-2蛋白表达、降低Bax及Bnip-3蛋白表达有关。

关键词：白花丹参；糖尿病心肌病；心肌细胞；细胞凋亡

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病(DM)的严重并发症，是DM患者的主要死亡原因之一[1]。目前，DCM的发病机制尚未完全明确，心肌细胞凋亡在DCM的发生发展中具有重要作用。厄贝沙坦是血管紧张素Ⅱ受体阻断剂，可通过阻断血管紧张素作用从而抑制DCM的发展[2]。白花丹参为泰山特有珍稀药用植物，具有良好的降糖、调脂、改善血流动力学作用。研究发现，白花丹参可抑制DCM的发生和发展，具有抗氧化、抗炎、抑制晚期糖基化终未产物(AGEs)形成的作用。B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白是抗凋亡蛋白，Bcl-2相关X(Bax)蛋白、Bcl-2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(Bnip-3)是促凋亡蛋白，均参与心肌细胞的凋亡过程。2014年9月～2015年1月，我们观察了白花丹参对DM大鼠心肌细胞凋亡的影响并探讨其机制，为其临床应用提供实验依据。

1材料与方法

1.1动物及试剂健康雄性Wistar大鼠60只，由山东鲁抗公司实验动物中心提供，质量合格证号20141012号，体质量200～220 g。链脲佐菌素(STZ)购自北京博爱科贸有限公司；兔抗鼠Bcl-2、Bnip-3、Bax多克隆抗体、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；厄贝沙坦购自浙江华海药业股份有限公司。

1.2白花丹参提取物制备将白花丹参块根切片后，加适量蒸馏水浸泡2 h，加热煮沸。先用强火，煮沸后改用文火，继续微沸30 min。过滤后，剩余药渣再加适量蒸馏水煮沸30 min，过滤后合并上述滤液，经旋转蒸发仪浓缩、蒸馏水稀释至所需浓度灌封，4 ℃保存备用。

1.3DM模型制备选择48只大鼠予高糖高脂饲料饲养1个月，按STZ 35 mg/kg经尾静脉一次性注射制备DM模型。72 h后尾尖取血，检测毛细血管血糖，以血糖≥16.7 mmol/L为DM模型造模成功[3,4]。

1.4分组及干预方法将48只DM模型大鼠随机分为糖尿病组(DM组)、白花丹参小剂量组(LD组)、白花丹参大剂量组(HD组)、厄贝沙坦组(WD组)，每组各12只。其余未造模的12只正常大鼠作为正常对照组(NC组)，正常饲养。造模成功后，LD组、HD组分别以白花丹参提取物15、30 g/(kg·d)灌胃，WD组予以厄贝沙坦17.5 mg/(kg·d)灌胃，DM组以等剂量的生理盐水灌胃,共干预4周。NC组不干预。

1.5血糖水平检测于灌胃的第4周末，末次给药后，禁食12 h，断尾取尾静脉血测定空腹血糖(FPG)。

1.6心肌组织病理观察采用HE染色法。取心肌组织，心肌切片常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇浸泡至水，PBS冲洗，切片上加入TdT和DIG-dUTP混合液置于湿盒中37 ℃标记2 h，加封闭液、生物素化抗地高辛抗体，DAB显色。以不加TdT作为阴性对照。400倍高倍镜下观察心肌细胞凋亡情况，凋亡细胞表现为核固缩、染色质浓染呈深浅不一的棕褐色，正常细胞核呈蓝色。

1.7凋亡相关蛋白表达检测采用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bnip-3表达。取部分心肌制成10%组织匀浆，离心后取上清液，采用Lowry法测定心肌蛋白质含量。用10%的SDS-PAGE分离样品蛋白质，调整泳道蛋白上样量为30 mg，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，转硝酸纤维素膜，封闭后冲洗；将膜放入一抗中4 ℃过夜，然后将膜加入碱性磷酸酶标记的二抗中室温孵育1 h，显色后拍照，蛋白表达量以其与内参蛋白条带的灰度比值表示。

2结果

2.1各组FPG水平及心肌组织中凋亡相关蛋白表达比较NC组FPG正常，DM组、WD组、LD组、HD组FPG均高于NC组，LD组、HD组FPG均低于WD组、DM组，HD组FPG低于LD组(P均<0.01)。DM组Bcl-2蛋白表达低于其他各组，WD组、LD组Bcl-2蛋白表达均低于HD组(P均<0.01)。DM组Bax、Bnip-3蛋白表达均高于其他各组，WD组、LD组Bax、Bnip-3蛋白表达均高于HD组(P均<0.01)。见表1、图1。

表1　　　　各组大鼠FPG、心肌组织Bcl-2、Bax、

注 ：与DM组比较，*P<0.01；与HD组比较，#P<0.01。

2.2心肌组织病理观察NC组心肌细胞核呈蓝色，细胞核无固缩，细胞间界限清，心肌纤维走行正常。DM组心肌棕褐色多，细胞核坏死明显，凋亡细胞数量多，心肌纤维走行紊乱。WD组凋亡现象较DM组减轻，但也存在心肌纤维走行紊乱。LD组凋亡现象较DM组、WD组均减轻，棕褐色减少，心肌纤维走行有序。HD组凋亡细胞数最少，心肌纤维走行有序，心肌病理表现明显好于WD组和HD组。

注：1为NC组；2为DM组；3为WD组；4为LD组；5为HD组。

图1各组Bcl-2、Bax、Bnip-3蛋白表达

情况(Western blot法)

3讨论

DCM病变特点是在舒张功能早期即出现心肌损害，伴有心肌肥厚的发展，出现心肌细胞坏死、心肌纤维化[5]和心肌细胞凋亡[6]等。DCM的原因可能与氧化应激、炎症反应或其他导致心肌损伤的因素有关，最终均可出现心肌细胞凋亡，进而引起心肌功能失常，出现心力衰竭。细胞凋亡是细胞的程序性死亡过程，在心血管疾病、DCM和心肌细胞损伤中发挥重要作用。研究表明，抑制心肌细胞凋亡对心功能具有保护作用，可防止、延缓心衰的发生与发展[7]。

Bcl-2家族是心肌细胞凋亡过程中非常重要的调节因子[8]，根据功能主要分为两类，包括抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bnip-3、Bax等，均参与了心肌细胞的凋亡过程。研究发现，DM大鼠心肌细胞中Bcl-2蛋白表达降低，与心肌细胞的凋亡密切相关[9～11]。研究表明，Bcl-2表达的减少可能与腺苷酸活化激酶(AMPK)的活性降低有关，从而促进细胞凋亡[12]。Bcl-2有抗氧化应激、阻断Ca2+从内质网释出的作用，并能决定线粒体渗透性转换孔开关的状态，从而调控凋亡过程。Bax基因可以促进细胞凋亡，这种作用与线粒体的活性氧(ROS)系统激活有关[13]。研究发现，通过增加DM大鼠心肌组织Bcl-2/Bax值，可抑制心肌细胞凋亡，延缓DCM的发生发展[14]。Bnip-3是近年来受到关注的促凋亡因子，在细胞内与线粒体相互作用后可引起心肌细胞氧化。在高血糖时，这种作用可上调线粒体呼吸和氧化应激相关基因的表达，并直接影响细胞线粒体跨膜电势差、促进心肌脂肪酸氧化代谢，发挥促凋亡功能。研究发现，Bnip-3参与了DM心肌细胞内炎症因子表达上调和调控钙稳态，在DCM的病变过程中具有一定作用。因此，Bcl-2、Bnip-3、Bax作为调控细胞凋亡的重要因素，可作为DCM重要标志性蛋白，为治疗DCM提供了有效靶点。本研究发现，DM组心肌细胞凋亡数量多,Bcl-2蛋白表达降低，Bax、Bnip-3蛋白表达增高，提示DM大鼠出现明显的心肌细胞凋亡，并出现凋亡相关蛋白Bcl-2、Bnip-3、Bax蛋白的表达异常。

白花丹参具有丹参的药理作用，其丹参酮ⅡA的含量是普通丹参的2倍，隐丹参酮、丹酚酸以及微量元素的含量比普通丹参高数倍。研究表明，白花丹参的水溶性成分具有很强的抗脂质过氧化、自由基清除作用，并对血脂和血糖有调节作用[15]。目前，白花丹参已广泛用于防治冠心病、脑血管病和外周血管的多种病变，但对其在DM慢性并发症及DCM治疗中的作用尚无研究。本研究发现，LD组、HD组FPG均低于WD组、DM组，HD组FPG低于LD组，提示白花丹参对DM大鼠血糖有良好的控制作用，且高剂量应用时降糖效果更好；WD组、LD组、HD组凋亡现象较DM组减轻，且HD组心肌病理表现明显好于WD组和LD组，提示白花丹参可明显减轻DCM细胞凋亡，且优于WD组；DM组Bcl-2蛋白表达低于其他各组，Bax、Bnip-3蛋白表达均高于其他各组，HD组Bcl-2蛋白表达均高于WD组、LD组，而Bax、Bnip-3蛋白表达均低于WD组、LD组，提示白花丹参可有效提高心肌Bcl-2蛋白含量，降低心肌Bax、Bnip-3蛋白含量，抑制心肌细胞凋亡。

综上所述，白花丹参可抑制DM大鼠心肌细胞的凋亡，其机制可能与提高心肌组织Bcl-2蛋白、降低心肌Bax、Bnip-3蛋白表达有关，从而延缓DCM的发病进程。

参考文献：

[1] Jeong JO, Kim MO, Kim H, et al.Dual angiogenic and neurotrophic effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cells on diabetic neuropathy[J]. Circulation, 2009,119(5):699-708.

[2] 替米沙坦对2型糖尿病大鼠心肌病变的干预研究[J].河北医药,2009,31(22):3041-3043.

[3] 郭啸华，刘志红，李恒，等.高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠模型及其肾病特点[J].中国糖尿病杂志，2002,10(5):290-294.

[4] 邓丽娟，陈慎仁，刘丽珍.2型糖尿病大鼠心肌病变模型的制备[J].中国临床康复，2005，9(19)；236-237.

[5] 刘冬戈，乔旭柏，杜俊，等.糖尿病心肌病的组织病理学观察[J].中华病理学杂志，2007，36(12)：801-804.

[6] Huynh K, Bernardo BC, McMullen JR, et al. Diabetic cardiomyopathy:mechanisms and new treatment strategies targeting antioxidant signaling pathways[J].Pharmacol Ther， 2014,142(3):375-415.

[7] Lee Y, Gustafsson AB. Role of apoptosis in cardiovascular disease[J]. Apoptosis, 2009,14(4):536-548.

[8] Gross ER, Hsu AK, Gross GJ. The JAK/STAT pathway is essential for opioid-induced cardioprotection:JAK2 as a mediator of STAT3,Akt,and GSK-3 beta[J]． Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006,291(2)：827-834.

[9] Abdel-Raheem MH, Salim SU, Mosad E, et al. Antiapoptotic and antioxidant effects of carvedilol and vitamin E protect againstdiabetic nephropathy and cardiomyopathy in diabetic Wistar albino rats[J]. Horm Metab Res, 2015,47(2):97-106.

[10] Wang H, Bei Y, Lu Y, et al.Exercise prevents cardiac injury and improves mitochondrial biogenesis in advanced diabetic cardiomyopathy with PGC-1α and Akt activation[J]. Cell Physiol Biochem, 2015,35(6):2159-2168.

[11] Wu TG, Li WH, Lin ZQ, et al. Effects of folic acid on cardiac myocyte apoptosis in rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus[J]. Cardiovasc Drugs Ther, 2008,22(4):299-304.

[12] He C, Zhu H, Li H, et al. Dissociation of Bcl-2-Beclin1 complex byactivated AMPK enhances cardiac autophagy and protects against cardiomyocyte apoptosis in diabetes[J]. Diabetes, 2013,62(4):1270-1281.

[13] Loor G, Kondapalli J, Iwase H, et al． Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion[J]. Biochim Biophys Acta, 2011,1813(7):1382-1394.

[14] 顾文元，李文静，赵伟,等.艾塞那肽对糖尿病大鼠心肌组织Bcl-2、Bax表达的影响[J].山东医药，2014，54(8)：17-20.

[15] 李大伟，夏青，夏作理.白花丹参对高脂血症大鼠血脂和血糖的调节作用[J].时珍国医国药，2007，4(18)：794-795.

Effects of Salvia miltiorrhiza water-extract on apoptosis of myocardial cells in rats with diabetes mellitus

HUANGDonghui1,LIGuanghong,HANJingjing,HOULijun

(1TaishanMedicalCollege,Taian271000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Salvia miltiorrhiza water-extract on apoptosis of myocardial cells in rats with diabetes mellitus (DM).MethodsForty-eight male Wistar rats were fed with high-glucose and high-fat diet and then were injected with streptozotocin (35 mg/kg) to establish diabetes mellitus (DM) models. After that, all model rats were randomly divided into the DM group (DM group), Western medicine group (WD group), low-dose (LD) and high-dose (HD) Chinese medicine groups, 12 rats in each group. Meanwhile, another 12 healthy rats were selected as the normal control group (NC group).After modeling, LD and HD groups were given 15 g/(kg·d) and 30 g/(kg·d) Salvia miltiorrhiza water-extract through intragastric administration, WD group was given 17.5 mg/(kg·d) irbesartan, and DM group was treated with the same dose of normal saline for 4 weeks. On week 4 after modeling, the expression of apoptosis-related protein (Bcl-2), Bcl-2-related protein (Bax) and Bnip-3 was detected by Western blotting.ResultsThe apoptosis of myocardial cells in the DM group was more significant, the apoptosis of the WD and LD groups alleviated as compared with that of the DM group, and the pathological manifestations of the HD group was better than that of the WD and LD group. The Bcl-2 protein expression of the DM group was lower that of the other groups, and the Bcl-2 protein expression of the WD and LD groups was lower than that of the HD group (all P<0.01). Bnip-3 and Bax protein expression of the DM group was higher than that of the other groups, and Bnip-3 and Bax protein expression of the WD and LD groups was higher than that of the HD group (all P<0.01). ConclusionSalvia miltiorrhiza water-extract can alleviate the apoptosis of myocardial cells in DM rats, and the mechanism may be related to the increased Bcl-2 protein expression and the decreased Bnip-3 and Bax protein expression.

Key words:Salvia miltiorrhiza water-extract; diabetic cardiomyopathy; myocardial cells; apoptosis

(收稿日期：2015-11-04)

中图分类号：R541.9；R587.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)14-0007-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.003

第一作者简介：黄东辉(1978-)，男，硕士学位，副教授，主要研究方向为内分泌与代谢疾病。E-mail: ahuang1115 @126.com

基金项目：山东省中医药科技发展计划项目(2011-226);山东省高等学校科技计划项目(J12LL03)。