李青，邓琦，赵明峰，李玉明(1天津医科大学一中心临床学院，天津300070；天津市第一中心医院)



利妥昔单抗对CIK细胞杀伤活性及细胞毒作用的影响

李青1,2，邓琦2，赵明峰2，李玉明2(1天津医科大学一中心临床学院，天津300070；2天津市第一中心医院)

摘要：目的观察利妥昔单抗对细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞杀伤活性及细胞毒作用的影响，为利妥昔单抗的临床应用提供依据。方法取15例健康供者外周血制备CIK细胞，分为对照组、观察1组、观察2组。观察1组、观察2组分别加入5×104、10×104 μg/L的利妥昔单抗，对照组不加入利妥昔单抗。干预第14天时，以流式细胞仪检测CIK细胞免疫表型CD3+、CD3+CD56+的表达，以酶联免疫吸附法检测上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)水平，以流式细胞仪检测CIK细胞表面活化性受体NKG2D(CD314)及CIK细胞中颗粒酶B、穿孔素的表达。将每组CIK细胞复设3孔，分别与髓系白血病细胞株K562和B细胞淋巴瘤细胞株SU-DHL2以10∶1、20∶1、40∶1共培养，采用MTT法测定各组对K562细胞及SU-DHL2细胞的杀伤活性。结果各组CD3+、CD3+CD56+表型差异无统计学意义(P均>0.05)。观察1组、观察2组细胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平均高于对照组(P均<0.05)。观察1组、观察2组CIK细胞表面CD314及细胞中颗粒酶B、穿孔素的表达均高于对照组(P均<0.05)。各组CIK细胞在10∶1、20∶1、40∶1效靶比时对K562细胞、SU-DHL2细胞的杀伤活性均高于对照组(P均<0.05)。结论利妥昔单抗可增强CIK细胞的杀伤活性，对髓系白血病细胞及B细胞淋巴瘤细胞均具有细胞毒作用。

关键词：利妥昔单抗；细胞因子诱导杀伤细胞；白血病；淋巴瘤

急性白血病(AL)完全缓解后体内的残留病灶是导致AL复发的根源。利用具有杀伤肿瘤细胞活性的免疫活性细胞清除AL残留病灶，是预防AL复发的重要方法。细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞是一组CD3+CD56+细胞，同时具有T细胞的抗瘤活性和NK细胞的非主要组织相容性复合体(MHC)限制性杀瘤特点，是目前血液肿瘤生物免疫治疗中应用最广泛、最具有发展前景的细胞之一[1]。CIK细胞可分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、IL-2等具有细胞杀伤作用的细胞因子，其细胞表面活化性受体NKG2D(CD314)也具有杀伤活性。如何提高CIK细胞的杀瘤活性是提高其临床应用效果的必要前提。利妥昔单抗是人-鼠嵌合性抗CD20单克隆抗体，对于B细胞淋巴瘤具有较好的疗效[2～5]。目前，对利妥昔单抗是否可影响CIK细胞对AL细胞的杀伤能力尚不明确。2014年10月～2015年10月，我们应用利妥昔单抗干预CIK细胞，观察对CIK细胞的杀伤活性及细胞毒作用的影响，为利妥昔单抗的临床应用提供实验依据。

1材料与方法

1.1细胞及试剂髓系白血病细胞株K562和B细胞淋巴瘤细胞株SU-DHL2为本实验室保存。重组人白细胞介素2(rhIL-2)、IFN-γ购自北京四环生物制药公司；CD3单克隆抗体购自北京同立海源生物科技有限公司；利妥昔单抗购自上海罗氏制药公司；FITC标记的鼠抗人CD3、CD56及同型对照购自美国BD公司；PE标记NKG2D(CD314)购自美国Biolegend公司；PE标记穿孔素、颗粒酶B购自美国Biolegend公司。

1.2外周血CIK细胞制备取15例健康供者外周血各20 mL，作为体外培养的CIK细胞来源。肝素抗凝，经Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用完全培养液(含5%胎牛血清的RPMI 1640培养液)悬浮，调整细胞密度为1×105/mL备用。

1.3分组及干预方法取6孔培养板，将CIK细胞以1×106/孔培养，分为对照组、观察1组、观察2组。各组加入1×106U/L的IFN-γ后，置于37 ℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。24 h后再加入1×106U/L的IL-2、50 μg/L的CD3单抗，观察1组、观察2组再分别加入5×104、10×104μg/L的利妥昔单抗。对照组不加入利妥昔单抗干预。

1.4CIK细胞表型检测干预第14天时收集2×105个细胞，以流式细胞仪检测CIK细胞免疫表型CD3+、CD3+CD56+的表达，评价利妥昔单抗干预后CIK细胞表型的变化。

1.5细胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平检测干预第14天时取各组上清，以酶联免疫吸附法检测上清液中TNF-α、IFN-γ水平，评价CIK细胞分泌具有杀伤效应细胞因子的功能。

1.6CIK细胞表面CD314及细胞中颗粒酶B、穿孔素检测干预第14天时，收集2×105个细胞，以流式细胞仪检测CIK细胞表面CD314的表达，检测CIK细胞中颗粒酶B、穿孔素的表达，评价CIK细胞的杀伤活性。

1.7细胞毒作用观察采用MTT法。取96孔培养板，将每组CIK细胞复设3孔，分别与K562细胞以10∶1、20∶1、40∶1进行共培养，另设CIK细胞对照孔、K562细胞(靶细胞)对照孔。同法处理SU-DHL2细胞。孵育72 h后，离心去上清，加入MTT试剂20 μL(50 g/L)，加入二甲基亚砜150 μL，酶联免疫检测仪(波长570 nm)检测吸光度(OD)值，重复测3次取均值,计算杀伤活性。杀伤活性(%)=[1-(OD实验孔-OD细胞对照孔)/OD靶细胞对照孔]×100%。

2结果

2.1各组CIK细胞CD3+、CD3+CD56+表达比较各组CD3+、CD3+CD56+表达差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1　各组CIK细胞CD3+、CD3+CD56+表达比较

2.2各组细胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平比较观察1组、观察2组细胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平均高于对照组(P均<0.05)。见表2。

表2　各组细胞上清液TNF-α、IFN-γ水平比较(ng/L)

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3各组CIK细胞表面CD314及细胞中颗粒酶B、穿孔素表达比较观察1组、观察2组CIK细胞表面CD314及细胞中颗粒酶B、穿孔素的表达均高于对照组(P均<0.05)。见表3。

表3　　　　各组CIK细胞表面CD314及细胞中颗粒酶B、

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.4各组CIK细胞对K562、SU-DHL2细胞的杀伤活性比较各组CIK细胞在10∶1、20∶1、40∶1效靶比时对K562细胞、SU-DHL2细胞的杀伤活性均高于对照组(P均<0.05)。见表4、5。

表4　各组CIK细胞对K562细胞杀伤活性比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

表5　　　　各组CIK细胞对SU-DHL2细胞杀伤活性

注：与对照组比较，*P<0.05。

3讨论

AL和恶性淋巴瘤复发是导致治疗失败及患者死亡的根本原因，清除残存的肿瘤细胞是患者缓解后治疗的主要目的。CIK细胞在体外及体内均具有良好的抗肿瘤活性，广泛应用于生物免疫治疗领域。但血液系统肿瘤由于存在免疫编辑作用，加之多疗程化疗对患者正常T细胞功能存在抑制作用，可导致患者的CIK细胞增殖能力及杀伤效应降低[6,7]，进而影响生物治疗的效果。血液肿瘤患者的CIK细胞活性降低与肿瘤早期复发相关，因此，提高CIK细胞杀伤效应可提高生物免疫治疗的效果，更好地清除残留病灶、预防复发、延长患者生存期。

利妥昔单抗是以基因工程研制的高纯度部分可变区(R)为鼠源，其他部分和恒定区为人源的人鼠嵌合型单克隆抗体，其主要靶点为B细胞表面CD20抗原，广泛应用于B细胞淋巴瘤的治疗。利妥昔单抗可与B细胞的CD20抗原结合，直接诱导B淋巴细胞瘤凋亡，其机制可能为通过抗体依赖细胞介导细胞毒效应(ADCC)和补体依赖的细胞毒效应(CDC)效应杀伤肿瘤细胞[8]。此外，利妥昔单抗可通过ADCC效应促进单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等释放穿孔素、颗粒酶B、TNF-α等，发挥杀伤靶细胞作用。但利妥昔单抗是否可增强CIK细胞的活性尚不清楚。CD3+CD56+是CIK细胞的表型，对于杀伤作用的发挥具有主要作用。本研究发现，各组CIK细胞CD3+、CD3+CD56+表达差异无统计学意义，提示利妥昔单抗干预CIK细胞后对细胞的表型无明显影响，仍保留CIK细胞的杀伤作用。

CIK细胞可分泌多种细胞因子。CIK细胞分泌的TNF-α、IFN-γ不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应间接杀伤肿瘤细胞[9,10]。本研究发现，观察1组、观察2组细胞上清液TNF-α、IFN-γ水平均高于对照组，提示利妥昔单抗干预CIK细胞后，可增加CIK细胞分泌TNF-α、IFN-γ等细胞因子的功能，从而增强CIK细胞的抗肿瘤作用。

CD314是介导CIK细胞杀伤活性的主要活化性受体，也是肿瘤细胞与CIK细胞发生免疫编辑的靶点[11,12]。肿瘤患者体内的CIK细胞受肿瘤细胞的编辑，使表面活化性受体CD314表达下降，导致CIK细胞的杀伤活性降低。颗粒酶B、穿孔素存在于CIK细胞的胞质中，是细胞毒效应分子，可直接活化凋亡蛋白酶进而诱导靶细胞的凋亡。此外，颗粒酶B还可以通过甘露糖-6磷酸受体介导的胞吞作用摄入靶细胞，经穿孔素作用破坏靶细胞的核内膜，进而通过线粒体途径诱导靶细胞的凋亡，是CIK细胞发挥杀伤作用的主要效应分子[13,14]。本研究发现，观察1组、观察2组CIK细胞表面CD314及细胞中颗粒酶B、穿孔素的表达均高于对照组，提示利妥昔单抗增加了CIK细胞表面CD314的表达，增加了细胞中颗粒酶B、穿孔素的释放，从而增强了杀伤活性，可能与利妥昔单抗抑制CIK细胞的免疫编辑作用有关。

利妥昔单抗作为B细胞表面标志物CD20的单克隆抗体，对于B细胞淋巴瘤的治疗具有特异性效果。本研究发现，各组CIK细胞在10∶1、20∶1、40∶1效靶比时对SU-DHL2细胞的杀伤活性均高于对照组，提示利妥昔单抗干预CIK细胞后，提高了对B细胞淋巴瘤细胞的杀伤活性，可能与利妥昔单抗的直接杀伤作用有关，也可能与利妥昔单抗提高CIK细胞的杀伤活性有关；各组CIK细胞在10∶1、20∶1、40∶1效靶比时对K562的杀伤活性也高于对照组，提示虽K562细胞表面CD20抗原表达较低，但CIK细胞对其的杀伤作用仍增强，考虑虽利妥昔单抗是抗CD20单抗，也可增强对不具有CD20抗原的髓系白血病细胞的细胞毒作用，表明利妥昔单抗既可以杀伤髓系白血病细胞，也可以杀伤B细胞淋巴瘤细胞，可能不仅通过CD20靶点发挥作用，也可能与增强CIK细胞分泌TNF-α、IFN-γ、颗粒酶B及穿孔素等从而增强CIK细胞的杀伤活性有关。

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Effect of rituximab on killing activity and cytotoxicity of cytokine-induced killer cells

LIqing1,DENGQi,ZHAOMingfeng,LIYuming

(1FirstCentralClinicalCollegeofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:Objective To investigate the effect of rituximab on killing activity and cytotoxicity of cytokine-induced killer (CIK) cells and to provide basis for the clinical application of rituximab.MethodsCIK cells from peripheral blood of healthy donors were prepared and then were divided into the control group, observation group 1 and observation group 2. The observation group 1 and observation group 2 were respectively added with 5×104, 10×104 μg/L rituximab and the control group was not treated. On day 14, the expression of CD3+, CD3+CD56+ was analyzed by flow cytometry, the levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon γ (INF-γ) were detected by enzyme-linked immunosorbent method, and the expression of CD314, granzyme B and perforin in the CIK cells of the three groups was detected by flow cytometry. In the three groups, three holes of CIK cells were reset to co-culture with K562 cells and SU-DHL2 cells with the ratios of E/T (10∶1, 20∶1 and 40∶1), and then the cytotoxicity of the CIK cells against K562 or SU-DHL2 cell lines were measured using MTT. Results The phenotypes of CD3+, CD3+CD56+ had no statistical difference among these three groups (P>0.05). The levels of INF-γ and TNF-α in the supernatant of the observation group 1 and observation group 2 were higher than that of the control group (P<0.05). The expression of CD314, granzyme B and perforin in the observation group 1 and observation group 2 were higher than that of the control group (all P<0.05). Cytotoxicity against SU-DHL4 or K562 cells at different ratio of E/T (10∶1, 20∶1 and 40∶1) in the observation group 1 and observation group 2 were higher than that of the control group (all P<0.05). ConclusionRituximab can improve the killing activity of CIK cells and has cytotoxic effect on the myeloid leukemia cells and B-lymphoma cells.

Key words:rituximab; cytokine-induced killer cells; leukemia; lymphoma

(收稿日期：2015-12-09)

中图分类号：R733.7

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)14-0021-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.007

通信作者简介：赵明峰(1971-)，男，主任医师，主要研究方向为肿瘤免疫及造血调控。E-mail: zmfzmf@hotmail.com

第一作者简介：李青(1979-)，女，主治医师，主要研究方向为恶性血液病系统诊治。E-mail: 15522388022@163.com

基金项目：天津市卫生局科技基金资助项目(2014KZ021)；天津市卫生行业重点攻关项目(13KG106)。