许聿新，井庆平，赵翠红(淄博市第一医院，山东淄博255200)



·论著·

骨髓间充质干细胞旁分泌效应对胰腺β细胞增殖、凋亡及分泌功能的影响

许聿新，井庆平，赵翠红(淄博市第一医院，山东淄博255200)

摘要：目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)旁分泌效应对胰腺β细胞系INS-1细胞增殖、凋亡及胰岛素分泌的影响。方法培养BMSCs，以胰腺提取物(RPE)模拟胰腺微环境培养BMSCs后，获取BMSCs的条件培养液(BMSCs-CM)。将细胞分为A组、B组、C组，分别以BMSCs-CM、不含RPE的条件培养液、等量RPMI 1640培养液培养。采用MTT法观察各组细胞增殖情况，计算细胞增殖率。采用AnnexinⅤ/PI法观察各组细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。应用放射免疫法(RIA)测定各组胰岛素水平。结果 A组细胞增殖率高于B组及C组(P均<0.05)。A组细胞凋亡率低于B组及C组(P均<0.05)。在葡萄糖溶液终浓度为5.6及20.0 mmol/L时，A组胰岛素水平均高于B组及C组(P均<0.05)。结论BMSCs-CM培养INS-1细胞后可促进其增殖、抑制其凋亡并促进其分泌胰岛素，BMSCs可能通过旁分泌效应发挥以上作用。

关键词：干细胞，骨髓；胰腺β细胞；细胞因子；凋亡；增殖

糖尿病的主要发病机制之一为胰岛β细胞的增殖及凋亡失衡，导致胰岛β细胞团不足，不能分泌充足的胰岛素。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是重要的种子细胞，移植BMSCs到胰腺后可以改善糖尿病大鼠的高血糖状态，但其机制尚未明确[1,2]。研究发现，移植到体内的BMSCs并不能直接分化为胰岛素分泌细胞，从而增殖为有功能的胰岛β细胞团[3]。但BMSCs在不同的微环境影响下可以分泌不同的细胞因子，从而调节周围细胞的增殖、凋亡及血管生成等，发挥重要的旁分泌作用。因此，BMSCs旁分泌效应可能在改善靶器官功能、抗凋亡方面发挥重要的作用。我们前期研究发现，以胰腺提取物(RPE)模拟胰腺微环境培养BMSCs后，可使BMSCs通过旁分泌效应分泌多种对胰腺具有保护作用的细胞因子[4]。但这种BMSCs旁分泌效应对胰腺β细胞增殖、凋亡及胰岛素分泌的影响尚不明确。 2015 年1～6月，我们用RPE处理BMSCs后的条件培养液(BMSCs-CM)孵育胰腺β细胞系胰岛细胞瘤INS-1细胞，观察BMSCs旁分泌效应对INS-1细胞增殖、凋亡及胰岛素分泌的影响，探讨BMSCs移植治疗糖尿病的机制。

1材料与方法

1.1动物及试剂雄性Wistar大鼠20只，体质量160～220 g，6～8周龄，清洁级，购自山东大学实验动物中心。大鼠INS-1细胞由佛罗里达大学医学院馈赠。主要试剂：RPE参照文献[4]制备，包含胰腺中多种多肽及细胞因子；FITC-羊抗鼠二抗IgG(Beckman Coulter公司)；PI(美国Sigma公司)；AnnexinⅤ-FITC(美国BD公司)。

1.2BMSCs培养及鉴定处死大鼠，采用全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs。48 h后，可见少量贴壁细胞，经过3代后BMSCs基本达到形态均一。流式细胞仪分析第3代BMSCs细胞表型，以细胞高表达CD44和CD90，而CD34、CD45低表达或表达阴性，为BMSCs培养成功。

1.3BMSCs-CM制备[5,6]取第3代BMSCs，培养于含10%FBS的LG-DMEM的培养板中，培养基中加入RPE培养7 d，然后用无血清培养液继续培养48 h，获得BMSCs-CM。

1.4分组及干预方法将INS-1细胞分为A组、B组、C组，分别以BMSCs-CM、不含RPE的条件培养液、等量RPMI 1640培养液培养。

1.5BMSCs-CM对INS-1细胞增殖的影响观察采用MTT法。INS-1细胞接种于96孔板，每孔100 μL，5×103个/孔，培养24 h。各组处理同1.4。每组设5个复孔，培养44 h。吸去上清，加入新鲜RPMI 1640培养液80 μL，再加入MTT溶液，继续培养4 h。每孔加入二甲基亚砜溶解产物150 μL。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度值(OD)，每组设定6复孔。细胞增殖率=(实验组平均OD值-对照孔平均OD值)/对照孔平均OD值×100%。

1.6BMSCs-CM对INS-1细胞凋亡的影响观察采用AnnexinⅤ/PI法。INS-1细胞培养于含10%FBS的RPMI 1640培养液的24孔板，约5×105/孔，培养24 h后，改为无血清的RPMI 1640培养液。各组处理同1.4。孵育24 h后，添加促凋亡细胞因子混合物(IL-1β 10 ng/mL、TNF-α 50 ng/mL及 IFN-γ 50 ng/mL)孵育18 h。收集细胞，重悬于195 μL结合液。加入Annexin V-FITC 5 μL，室温避光孵育10 min。加入结合液重悬细胞，碘化丙啶染色。荧光显微镜观察凋亡细胞，正常INS-1细胞不被荧光标记，早期凋亡细胞被Annexin V染色，镜下呈绿色；晚期凋亡细胞或坏死细胞被PI染色或同时被Annexin V及PI染色，镜下见细胞核呈红色，或细胞核的红色和细胞膜的绿色同时存在。随机选取6个视野，流式细胞仪计数早期凋亡细胞数、晚期凋亡数及凋亡细胞总数。细胞凋亡率=凋亡细胞总数/细胞总数×100%。

1.7BMSCs-CM对INS-1细胞胰岛素分泌的影响观察INS-1细胞培养于24孔板中，调整细胞数为5×104/L，孵育48 h。各组处理同1.4。温箱孵育48 h。每孔中加入葡萄糖溶液，调整终浓度分别为5.6 mmol/L及20.0 mmol/L，孵育4 h，取样500 μL，应用放射免疫法(RIA)测定胰岛素浓度。

2结果

2.1BMSCs-CM对INS-1细胞增殖的影响A组细胞增殖率高于B组及C组(P均<0.05)。B组与C组细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2BMSCs-CM对INS-1细胞凋亡的影响 A组细胞凋亡率低于B组及C组(P均<0.05)。三组早期及晚期凋亡细胞数差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.3BMSCs-CM对INS-1细胞胰岛素分泌的影响在葡萄糖溶液终浓度为5.6 mmol/L及20.0 mmol/L时，A组胰岛素水平高于B组及C组(P均<0.05)。见表1。

表1　三组细胞增殖率、凋亡率、凋亡细胞数及胰岛素水平比较±s)

注：与A组比较，*P<0.05。

3讨论

BMSCs在不同微环境下的调控下，可以分泌不同的细胞因子，这种效应被称为BMSCs旁分泌效应[7]。BMSCs分泌的多种细胞因子可通过作用于邻近细胞而发挥旁分泌作用，广泛参与细胞增殖、凋亡、免疫调节、血管再生等病理生理过程[8]。研究发现，低氧环境培养BMSCs后，培养液中多种具有心肌保护作用的细胞因子表达上调，表明BMSCs旁分泌效应可能发挥抑制心肌细胞的凋亡，促进其增殖的作用[9,10]。应用模拟胰腺微环境的RPE预处理后，BMSCs可以显著增加具有胰腺保护作用的细胞因子的分泌，也表明BMSCs旁分泌效应可能发挥修复胰腺的作用。由于BMSCs移植到糖尿病模型体内并不能分化为胰岛素分泌细胞、替代受损的胰岛细胞，因此考虑高血糖的缓解可能与BMSCs移植后通过旁分泌效应分泌多种降血糖细胞因子有关，进而促进内源性胰岛细胞增殖、抑制其凋亡。

胰岛β细胞数量的维持是β细胞增殖及凋亡的动态平衡。正常成年胰腺β细胞被认为是相对分化成熟的细胞，但被细胞因子激活后可出现增殖，这些细胞因子主要有胰岛素样生长因子(IGF-1)、肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、VEGF等[11]。它们与细胞表面的受体相结合后，可发挥促进有丝分裂、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、修复损伤的作用。研究发现，应用IGF-1处理胰岛β细胞可以抑制细胞因子诱导的胰岛β细胞凋亡，减少NO的合成，促进胰岛细胞分泌胰岛素[12]。HGF可通过对抗氧化应激来减少游离脂肪酸诱导的RINm5F凋亡，对胰岛细胞具有促进增殖的作用[13]。bFGF及VEGF不仅对胰腺细胞具有促增殖作用，还可通过促进血管生成改善胰腺血供、促进胰腺修复[14,15]。本研究发现， A组增殖率高于B组及C组，提示应用REP制备的BMSCs-CM可促进INS-1细胞的增殖；A组细胞凋亡率低于B组及C组，提示BMSCs-CM可抑制IL-1β、TNF-α和IFN-γ诱导的INS-1细胞的凋亡；在葡萄糖溶液终浓度为5.6 mmol/L及20.0 mmol/L时，A组胰岛素水平均高于B组及C组，提示BMSCs-CM可促进INS-1细胞分泌胰岛素的能力，考虑以上效应均与BMSCs通过旁分泌效应分泌具有胰腺保护作用的细胞因子有关。

综上所述，BMSCs-CM培养INS-1细胞后可促进INS-1细胞的增殖、抑制其凋亡并促进其分泌胰岛素，BMSCs可能通过分泌多种胰腺保护细胞因子的旁分泌效应发挥以上作用，可能是移植BMSCs后逆转高血糖状态的重要机制。

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Influence of paracrine effects of bone mesenchymal stem cells on proliferation,apoptosis and secretion function of pancreatic β cell line

XUYuxin,JINGQingping,ZHAOCuihong

(TheFirstHospitalofZibo,Zibo255200,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of paracrine effects of bone mesenchymal stem cells (BMSCs) on the proliferation, apoptosis and insulin secretion of pancreatic β cell line INS-1 cells. MethodsThe BMSCs were cultured and BMSCs conditioned media (BMSCs-CM) were obtained by culturing BMSCs with rat pancreatic extracts (RPE) which simulated the pancreatic microenvironment. The INS-1 cells were divided into groups A, B and C, which were cultured with BMSCs-CM, conditioned media without RPE and RPMI 1640 culture solution, respectively. The influence of BMSCs-CM on INS-1 cell proliferation was analyzed by MTT. The cell proliferation rate was calculated. The effects of BMSCs-CM on the INS-1 cell apoptosis were measured by AnnexinⅤ/PI double staining. The rate of apoptosis was counted. The insulin concentration of INS-1 cells was analyzed by radioimmunoassay (RIA).ResultsThe cell proliferation rate in the group A was higher than that in group B and C (P<0.05). The apoptosis rate in the group A was lower than that in group B and C (P<0.05). The insulin concentration in the group A was higher than that in group B and C at the concentration of 5.6 mmol/L and 20.0 mmol/L (all P<0.05).ConclusionsThe incubation of BMSCs-CM can stimulate the INS-1 cell proliferation, inhibit the apoptosis, and promote the insulin secretion. The above actions of BMSCs may be achieved by paracrine effects.

Key words:stem cells, myeloid; pancreatic β cells; cytokines; apoptosis; proliferation

(收稿日期：2015-10-19)

中图分类号：R587.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)14-0001-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.001

通信作者简介：井庆平(1964-),男，本科，主治医师，主要研究方向为糖尿病慢性并发症的诊治。E-mail: jingqingping@sina.com

第一作者简介：许聿新(1978-),男，博士，主治医师，主要研究方向为糖尿病慢性并发症的诊治。E-mail: hongxin1978@sina.com

基金项目：山东省淄博市科学技术发展计划项目(2012GG01259)。