马帅，郭振奎，丁文宇，张勇，康晓丽，游雅丽(1济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南5006；山东省内分泌与代谢病研究所)



1个早发糖尿病合并肾发育异常家系的HNF1β基因分析

马帅1,2，郭振奎2，丁文宇2，张勇2，康晓丽1,2，游雅丽1,2(1济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南250062；2山东省内分泌与代谢病研究所)

摘要：目的分析1个符合青少年起病的成人糖尿病5型(MODY5)的早发糖尿病合并多发性肾囊肿家系，探讨其家系MODY5临床表型与肝细胞核因子1β(HNF1β)基因的关系。方法选择发现的1个MODY5患者家系，另选择健康体检者2例作为对照。对MODY5患者进行家系调查，收集家庭成员[包括先证者(Ⅱ4)、引产胎儿(Ⅲ1)、大姐(Ⅱ1)、二姐 (Ⅱ2)、三姐 (Ⅱ3)、父亲(Ⅰ1)]的疾病史。采集该家系中引产胎儿(Ⅲ1)脾脏，抽取该家系其他健在成员及对照者外周静脉血，提取外周血有核细胞DNA，应用聚合酶链式反应技术对HNF1β基因进行扩增及测序分析。结果先证者(Ⅱ4)、先证者父亲(Ⅰ1)、三姐(Ⅱ3)均为早发糖尿病合并多发性肾囊肿，先证者大姐(Ⅱ1)为多发性肾囊肿，二姐(Ⅱ2)仅有糖尿病一种表型。基因测序发现先证者大姐(Ⅱ1)的HNF1β基因第9外显子1968A>G、2142T>A、2312A>C编码区发生突变，家系其他成员及对照者未发现外显子编码区HNF1β基因突变。结论在该MODY5家系中仅发现1例HNF1β基因突变，MODY5临床表型与HNF1β基因型存在较大的异质性。

关键词：肝细胞核因子1β；肾发育异常；青少年起病的成人糖尿病

青少年起病的成人糖尿病(MODY)是一种呈常染色体显性遗传特点的单基因突变糖尿病，迄今已发现13种MODY亚型。在各种亚型中，MODY5亚型占MODY总人数的2%～5%[1]。MODY5亚型最常见的临床表型为肾脏发育异常和早发糖尿病。目前关于中国人MODY5亚型的报道较少见[2～4]。

2015年10月，我们发现1个临床表型符合MODY5亚型的早发糖尿病合并多发性肾囊肿家系，通过对该家系进行MODY5的致病基因肝细胞核因子1β(HNF1β)基因检测，探讨其家系临床表型与HNF1β基因的关系。现报告如下。

1资料与方法

1.1临床资料选择1个早发糖尿病合并多发性肾囊肿患者家系，包括先证者(Ⅱ4)、先证者子代引产胎儿(Ⅲ1)、大姐(Ⅱ1)、二姐 (Ⅱ2)、三姐(Ⅱ3)、父亲(Ⅰ1)。家系中先证者(Ⅱ4)为早发糖尿病合并多发性肾囊肿患者，男，24岁，因多尿、多饮就诊于我院，BMI为22.1 kg/m2，血压128/80 mmHg，随机静脉血糖15.24 mmol/L，糖化血红蛋白10.70%，尿糖(+++)，尿酮体(-)，肝肾功能正常。另选择同期在我院查体的健康体检者2例作为对照。

1.2家系调查对该患者进行家系调查，询问家族史、既往史，进行血糖、肾脏B超检查。

1.3标本收集及DNA提取胎儿36周引产后，经我院伦理委员会允许并经先证者知情同意后，对胎儿进行尸体解剖。取新鲜脾脏，用DNA试剂盒提取组织细胞DNA，-20 ℃保存，其余组织置于-70 ℃冰箱保存。另抽取该家系其他成员及对照组外周静脉血2～5 mL，用EDTA抗凝，DNA试剂盒提取外周血有核细胞DNA，低温-20 ℃保存备用，并使用核酸/蛋白浓度测定仪对已提取的DNA样品进行浓度测定。

1.4HNF1β基因扩增及测序遵守引物设计原则对HNF1β基因的每个外显子进行引物设计，应用聚合酶链式反应(PCR)技术对HNF1β基因序列进行多循环扩增。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，大连宝生物工程有限公司PCR纯化试剂盒纯化后，送上海生物工程有限公司进行测序分析。

2结果

2.1家系调查结果先证者(Ⅱ4)、先证者父亲(Ⅰ1)、先证者二姐(Ⅱ2)、三姐(Ⅱ3)均为早发糖尿病合并多发性肾囊肿，先证者大姐(Ⅱ1)为多发性肾囊肿。见图1。①先证者(Ⅱ4)：腹部B超示两肾出现多个回声不均、大小不一囊肿。②先证者妻(Ⅱ5)：23岁，第一胎妊娠期间第32周产检时，经B超发现胎儿(Ⅲ1)左侧肾缺如，右肾正常大小发育良好，未见囊肿等肾脏发育畸形，其他器官、部位发育良好，无畸形或缺如；追踪Ⅲ1母方家系成员无肾畸形等肾脏发育异常家族史。③先证者父亲(Ⅰ1)：确诊糖尿病的年龄为30岁，既往腹部B超示左肾有回声不均、大小不一的囊肿，37岁时因糖尿病、糖尿病肾病病故。④先证者母亲(Ⅰ2)：因患脑梗死病故，生前无血糖异常，追踪Ⅰ2家系无糖尿病、肾脏发育异常家族史。⑤先证者二姐(Ⅱ2)、三姐(Ⅱ3)：确诊糖尿病时年龄分别为14、16岁，当时空腹血糖13～14 mmol/L，尿酮体(-)，其中三姐(Ⅱ3)腹部B超示双肾有多个回声不均的囊肿，右侧肾发育不良。Ⅱ2、Ⅱ3确诊糖尿病3年后均死于酮症酸中毒。⑥先证者大姐(Ⅱ1)：30岁，BMI为24.3 kg/m2，血压128/80 mmHg，OGTT+C肽+胰岛素释放试验正常，空腹血糖4.6 mmol/L，糖化血红蛋白为5.4%，腹部B超示两肾多个回声不均、大小不一的囊肿。各家庭成员配偶间均为非近亲结婚。由于Ⅱ2、Ⅱ3和Ⅰ1均因糖尿病等急慢性并发症去世，未获得其有效标本和资料。

图11个MODY5家系图谱

2.2基因测序结果先证者大姐(Ⅱ1)的HNF1β基因突变位置均在第9外显子非编码区，分别为第9外显子第120位基因A/G杂合突变(外显子1968 A>G)、第9外显子第294位基因A/T杂合突变(外显子2142 T>A )、第9外显子第464位基因C/A杂合突变(外显子2312 A>C)。先证者(Ⅱ4)与对照者HNF1β外显子编码区域及启动子区均无突变位点。胎儿HNF1β外显子编码区域及启动子区均无突变位点，其他家系成员因病去世无法获得有效标本。见图2、3。

图2　正常对照者外显子序列1968位点测序图

图3　　　　先证者大姐(Ⅱ1)外显子序列1968 位点

3讨论

MODY糖尿病是一种在家系内以常染色体显性遗传方式传递的早发糖尿病，临床表现类似2型糖尿病，但却比2型糖尿病发病早，遗传外显率高，BMI多在正常范围，代谢综合征少见。MODY基因的一个位点拷贝异常就可导致胰岛细胞发育异常、胰岛素分泌缺陷等[5]。研究表明，HNF1β突变所致MODY5临床表型呈高度异质性，但最常见的是肾发育异常表型，大多是与糖尿病肾病无关的肾脏功能减退、肾囊肿、肾先天畸形、一侧肾缺如等；其次的常见表型是糖尿病，以胰岛素分泌障碍为特征，起病年龄多小于25岁[1]。MODY5家系突变在国外报道较多，而在国内报道较少。本研究发现先证者家系中，先证者(Ⅱ4)、先证者父亲(Ⅰ1)、先证者二姐(Ⅱ2)、三姐(Ⅱ3)均为早发糖尿病合并多发性肾囊肿，先证者大姐(Ⅱ1)为多发性肾囊肿,符合MODY5家系特征。

HNF1β基因是MODY5的致病基因[5]。HNF1β的主要靶基因有左旋丙酮酸激酶(PKL)、L型丙酮酸激酶、葡萄糖转运蛋白2(GLUT-2)及胰岛素基因等，通过参与以上基因的表达，在调节β细胞的分泌、参与机体血糖稳态调节中发挥重要作用[6～9]。HNF1β不仅存在于胰岛细胞核内，还广泛存在于肝脏、肾脏、肺脏、胆管系统、生殖系统等内脏细胞，HNF1β突变可导致以上组织中的靶基因表达异常，最终致器官组织细胞发育分化异常和分化终末细胞功能失调。研究发现，在HNF1β基因多态位点1968A>G突变中，G等位基因携带者空腹血糖、餐后3 h血糖、空腹胰岛素、餐后3 h胰岛素水平均高于A等位基因型，提示HNF1β基因1968 A>G突变可能导致β细胞负担加重，导致β细胞分泌功能逐步降低，最终引起糖尿病的发生[10]。本研究测序结果示，先证者大姐(Ⅱ1)的HNF1β基因第9外显子1968 A>G、2142 T>A、2312 A>C编码区发生突变，但OGTT+C肽+胰岛素释放试验结果在正常值范围内，未出现糖尿病，对照组无以上HNF1β基因位点突变，推测可能2102、2312位点突变产生反式激活作用来调控靶基因，从而拮抗1968点突变引起的β细胞分泌缺陷。此为HNF1β基因1968位点突变的个例，具体机制仍需要增加病例样本进一步探索。

本研究也发现该家系中存在临床表型与基因型的异质性。先证者(Ⅱ4)父亲(Ⅰ1)、三姐(Ⅱ3)虽出现早发糖尿病、多发性肾囊肿，但均未检测到HNF1β外显子编码区域及启动子区突变；胎儿(Ⅲ1)肾脏表型表现为左侧肾脏缺如，但其HNF1β基因编码区无突变；而大姐(Ⅱ1)虽出现1968A>G突变、合并表型肾囊肿，但未发现胰岛素拮抗情况，以上成员临床表型与基因型的异质性，考虑可能为基因多效性或在内含子中存在某些未知的调控区域，导致HNF1β基因表达受到不同程度的损害；或与相关基因的关联突变(例如同为同源结构域转录因子的HNF1α、IPF-1基因)，microRNA也可能参与其中，使HNF1β相关靶基因的表达产物异常或产量下调所致[12,13]。此外，其他遗传和环境因素也可在HNF1β突变的基础上进行调控，也可能是造成基因型与临床表型存在差异，出现高度异质性的原因[3]。

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(收稿日期：2015-01-08)

中图分类号：R587.1；R596

文献标志码：B

文章编号：1002-266X(2016)14-0052-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.018

通信作者：郭振奎(E-mail: mashuaixiami@163.com)

基金项目：山东省医学科学院科研基金面上项目(201207)。