曹 博 赵怡霞 江 嫚

(北京市第四中学顺义分校 101318)

朱 琳

(陕西省勉县第二中学 724200)

基因组编辑技术是利用核酸酶对基因组进行定向编辑的技术，主要用于研究特定基因的功能[1]。目前用于基因组编辑的核酸酶主要分为三类：锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)和归巢核酸内切酶(engineered meganucleases)。近年来，在分子生物学领域出现了一种新兴的RNA导向的基因组定点编辑技术—— CRISPR/Cas[2]，该系统因为操作简单、成本低等特点，迅速得到认可，并在不同研究领域得到广泛应用。

1 CRISPR/Cas系统结构

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)是指最初来自于E.coliK12 碱性磷酸酶基因附近区域的成簇的规律间隔的短回文重复序列[3]，随后发现约40%左右的已测序细菌基因组都存在CRISPR位点。Cas(CRISPR-associated nuclease)是存在于CRISPR位点附近的一系列保守基因，往往与重复序列相连，在 CRISPR 的防御体系中起关键作用。在Cas基因附近有一段帮助CRISPR RNA (crRNAs)成熟的转录活化RNA(tracrRNA)。通过CRISPR /Cas系统，细菌构建了一种特殊的防御系统，进而可以有效抵抗外源基因侵扰。根据Cas基因核心元件的不同，CRISPR /Cas系统可以分为三种类型：I型、II型和III型。其中I型和III型需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而II型只需要一个Cas9蛋白核酸酶进行切割，因此成为目前应用最为广泛的CRISPR/Cas9系统[4]。

2 CRISPR/Cas系统原理

II型CRISPR/Cas系统由三部分组成：tracrRNA、Cas9 核酸酶和pre-crRNA[5]，其具体作用机制可分为三个步骤：①适应阶段：Cas蛋白复合物靶向寻找并裂解外源基因中的原型间隔序列(protospacer)，随后protospacer整合到CRISPR位点5′端，并被转录成crRNA。外源基因再次进入时，CRISPR的重复序列会截取其中的一些片段，并将其转录形成pre-crRNA，之后与tracrRNA的重复序列结合。……