韩瑞钰 宋潇潇 张展羽 吴江乾 刘 杰 张香改*

1．河北省计划生育科学技术研究院遗传研究室（河北省生殖医学中心）（石家庄 050071）；2. 国家卫生计生委计划生育与优生重点实验室

·临床经验·

1875例不育症患者Y染色体微缺失的研究及评估

韩瑞钰1,2宋潇潇1,2张展羽1,2吴江乾1,2刘 杰1,2张香改1,2*

1．河北省计划生育科学技术研究院遗传研究室（河北省生殖医学中心）（石家庄 050071）；2. 国家卫生计生委计划生育与优生重点实验室

全球大约有10%～15%的夫妇不育，约50%是男性因素导致的，其中遗传因素是重要且原因明确的因素。遗传因素主要包括染色体病和Y染色体的微缺失，其中染色体病，包括染色体平衡易位、罗伯逊易位、倒位以及性染色体异常等。Y染色体长臂远端区域存在控制精子发生的基因为无精子症因子（azoospermic factor，AZF），这一区域的染色体微缺失可导致精子发生障碍。男性不育门诊中常常可见无精子症和少精子症患者，由遗传缺陷所引起的精子发生障碍约占男性不育因素的30%［1,2］，研究表明，Yq11区存在3个精子产生位点（AZFa 、AZFb、AZFc）， 任意1个位点出现缺失，临床上可表现为男性无精子症或严重少精子症。本文对1 875 例无精子症和严重少弱精子症患者进行染色体和AZF 缺失检测，旨在研究和评估临床男性不育患者与遗传性状的相关性。

资料与方法

一、研究对象

选择2011年3月至2015年10月到我院男科诊室就诊的1 875例男性不育患者，在排除了其他原因如感染等因素后对其进行精液常规分析。

二、方法

1．取精方式：包括手淫射精或睾丸穿刺。

2．分子遗传学方法AZF检测：用上海透景生命科技有限公司提供的Y染色体微缺失检测试剂盒，通过多重聚合酶链反应（PCR）扩增，检测Y染色体AZF区域内的6个序列标签位点（sequence tag site），包括AZFa区：SY84，SY86；AZFb区：SY127，SY134；AZFc区：SY254，SY255。内控对照为Y染色体性别决定SRY基因，每次实验均以已育健康男性基因组DNA作为阳性对照。多重PCR体系及扩增参照试剂盒说明书体系反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸30s，共扩增35个循环，最后72℃延伸10min，PCR扩增产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳，120V电泳90min，凝胶成像系统观察并照相，分析结果。

3．细胞遗传学检查取肝素钠抗凝外周血进行淋巴细胞培养，染色体制备，G、C显带。每例计数30个中期分裂相，分析5个核型，如染色体数目异常，计数100个中期分裂相，嵌合体患者计数100个中期分裂相。

三、统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，率的比较采用x2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、细胞遗传学检查结果

1 875例中检测出188例异常核型，核型异常率为10.03%，其中47, XXY 138例，46,X,del（Yq） 12例，46,XX 13例，46,XY,inv（9） 3例，46,XY,21S+ 2例，45,X/46,XY 1例，46,XY/47,XYY 1例，45,X/46,X,r（Y）1例，46,XY,r（15） 1例，易位16例。188例异常核型中，无精子症患者核型异常178例，发生率为19.00%（178/937）；少、弱精子症及严重少精子症患者核型异常10例，发生率为1.07%（10/938），两者差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

二、Y染色体在无精子症、少弱精子症和重度少精子症的缺失率比较

1 875名男性不育患者中，217例发生Y染色体微缺失，缺失率为11.6%。其中无精子症937例中172例发生Y染色体微缺失，缺失率为18.4%；少、弱精子症375中18例发生Y染色体微缺失，缺失率为4.8%，重度少精子症563例中27例发生Y染色体微缺失，缺失率为4.8%，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

三、Y染色体在不同区域的缺失率比较

217例微缺失患者中，无精子症172例，少弱精子症18例，严重度少精子症27例。AZF a区缺失8例，占3.7%；AZF b区缺失9例，占4.2%；AZF c区缺失122例，占56.2%；AZF b+c区缺失46例，占21.2%；AZF a+b+c区缺失32例，占14.7%。在217例Y染色体微缺失的男性患者中无精子症患者发生的缺失率明显高于少、弱精子症患者和严重少精子症患者。各区域缺失在无精子症患者、少弱精子症患者和重度少精子症患者的发生情况见表3。

表1 染色体异常核型

表2 在无精子症、少弱精子症和严重少精子症中Y染色体微缺失率比较

讨 论

引起男性不育的原因有很多，根据《WHO 男性不育标准化检查与诊疗手册》的病因分类，男性不育可分为17 种病因，其中无精子症和（严重）少精子症患者占有很大的比例，国内外研究表明，其与Y染色体微缺失相关，男性原发无精和少精症患者中大约有7.5%～15%存在Y染色体AZF区微缺失［3］。分子流行病学研究结果显示，中国人原发性无精子与严重少精子症患者群体AZF区STS（sequence-tagged sites）微缺失率均高于17%［4］，Chang等［5］报道，在台湾缺失率为9%。Kim等［6］报道在韩国缺失率为7.7%。Ambulkar等［7］报道印度男性不育患者Y染色体缺失率8.83%，其中在无精子症和重度少精子症患者的缺失率分别10.2%和7.4%。Zaimy等［8］报道，在伊朗男性不育患者中Y染色体缺失率为8%，其中在无精子症和重度少精子症患者中的缺失率分别为14.6%和3.3%。本研究显示，少弱精子症、重度少精子症和无精子症患者中Y染色体的缺失率为11.6%，略高于亚洲其他国家报道的数值，这与人种差异、研究对象的选择标准和不同的STS引物的选择等因素有关。本研究还显示，Y染色体微缺失在无精子症患者中缺失率为18.4%，少弱精子症患者中为4.8%，重度少精子症患者中为4.8%，高于我国东北地区报道的8.3% 和 5.5%［9］，表明地域差异可能也会影响不育男性Y染色体的缺失率。

研究表明，精子的产生是一个复杂的过程，需经过两次成熟分裂、核物质减半、细胞分化、形态转变等，受到染色体上众多基因的调控，相关基因的缺失可以不同程度地影响到精子的发生，并影响男性的生育能力。1976 年，Tiepolo等［10］发现6 例无精子症患者存在显微镜下可见的 Y 染色体长臂缺失，于是提出Y染色体长臂上可能存在着控制精子生成的基因，并将其称为无精子症因子（azoospermic factor，AZF）。AZF存在于Y染色体长臂远端（Yq11.23），其微缺失可以导致精子发生阻滞。1996年Vogt等［11］将AZF 划分为AZFa、AZFb、AZFc 3 个相互独立的区域，这些区域包括一些影响男胚细胞发育和维持的基因和基因家族，会影响精子的发生。睾丸活检呈生精阻滞时发现，微缺失发生于同一亚区时，精子发生阻滞在同一时相，反之，则阻滞在不同时相。一般分为AZFa区缺失的患者精子发生阻滞在青春期前阶段，其基因主导精母细胞的增殖，表现为唯支持细胞综合征（SCOS）和小睾丸，为绝对的无精子症，这类患者即使睾丸穿刺也无法获取精子，不可以做 ICSI。AZFb区缺失表现为生殖细胞成熟障碍，即睾丸内只见精原细胞和初级精母细胞，而精液中无精子。行睾丸穿刺也不能获得精子，因此对于该类患者也不可以通过 ICSI 的方式生育自己的孩子，只能通过供精的方式生育后代。AZFc区缺失情况比较复杂，表型多样，从轻度少精子症到无精子症。有的患者尚存精子生成能力，对于同一患者，一些生精小管内仅见支持细胞，而另一些生精小管内可见精原细胞、精母细胞、精子细胞甚至精子，其中2/3患者表现为无精子症，约50%的患者可以经睾丸穿刺获得精子，余下1/3表现为少精子症，因此AZFc 缺失者可以通过辅助生殖技术生育自己的后代，但是会将 AZFc 缺失遗传给男性后代,但是关于Y染色体微缺失是否影响患者的ICSI治疗结局，目前仅有少数的报道，且结果存在争议。本研究中，AZFc区的缺失率为56.2%，AZFb区域缺失率为41.5%，AZFb+c区缺失率为21.2%，AZFa区与AZFa+b+c区缺失率分别为3.7%和14.7%，符合 AZF区域微缺失与无精子症及少精子症之间的因果关系，并与国内外报道的AZFc区是主要的缺失区域，AZFa区发生率最低的观点一致［12］。

表3 Y染色体AZF不同区缺失在无精子症、少弱精子症和严重少精子症中的分布

Y 染色体微缺失是男性原发不育症的重要病因，对Y染色体缺失的检测已逐渐发展成为诊断遗传性男性不育的重要技术手段，不仅可以指导临床诊断，同时对减少遗传病的发生也具有重要意义。特别是AZF缺失的检测对于从分子水平明确无精子症或少精子症患者的病因、指导睾丸活检和卵胞浆内单精子显微注射具有重要意义，尤其是对AZFc区的研究尤为重要，这类患者会将缺失遗传给男性后代，女性后代不孕的风险通常不会增加，患者可以选择辅助生殖助孕治疗，进行胚胎移植前基因诊断（PGD），选择女胚进行移植。因此，Y染色体微缺失的检测不仅能找出非梗阻性无精子症和中重度少精子症男性不育的病因，也有助于患者选择辅助生殖治疗的方式，对于男性不育患者的诊治具有极其重要的临床意义，如何为这一部分患者提供遗传咨询和找到合适的解决生育的办法，为他们的生殖安全提供保障，仍然是当前研究的热点和难点，应该在这方面进行更深入的探索［13,14］。

无精子症；少精子症；弱精子症；Y染色体

1 Wong WY, Thomas CM, Merkus JM,et al. Male factor subfertility: possible causes and the impact of nutritional factors.Fertil Steril2000；73（3）: 435-442

2 Hellani A, Al-Hassan S, Iqbal MA,et al.Y chromosome microdeletions in infertile men with idiopathic olig-or azoospermia.J Exp Clin Assist Reprod2006；（3）: 1

3 Kleiman SE, Yogev L, Paz G,et al. The value of the site and extent of Y chromosome microdeletions on spermatogenesis.Harefuah2002；141（2）: 178-180.

4 杨元，张思仲，彭黎明, 等. 中国人原发无精与严重少精症Y染色体AZF区域微缺失的分子流行病学研究. 中华医学遗传学杂志 2003； 20 （5）: 385-389

5 Chang SY, Tsai MY. Detection of azoospermic factor genes in Chinese men with azoospermia or severe oligozoospermia.J Assist Reprod Genet1999；16（5）: 259-262

6 Kim MJ, Choi HW, Park SY,et al. Molecular and cytogenetic studies of 101 infertile menwith microdeletions of Y chromosome in 1306 infertile Korean men .J Assist Reprod Genet2012；29（6）: 539-546

7 Ambulkar PS, Sigh R, Reddy M,et al. Genetic risk of AZF microdeletions in idiopathic cases of azoospermia and oligozoospermia in central Indian population.J Clin Diagn Res2014；8（3）: 88-91

8 Zaimy MA, Kalantar SM, Sheikhha MH,et al.The frequency of Yq microdeletion in azoospermic and oligospermic Iranian infertile men.Iran J Repord Med2013；11（6）: 453-458

9 Fu L, Xiong DK, Ding XP,et al. Genetic screening for chromosomal abnormalities and Y chromosome microdeletions in Chinese infertile men .J Assist Repord Genet2012；29（6）: 521-527

10 Tiepolo L, Zuffardi O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the Y chromosome long arm.Hum Genet34, 119-124

11 Vogt PH, Edelmann A, Kirsch S,et al. Human Y chromosome azoospermia factors （ AZF） mapped to different subregions in Yq11. Hum Mol Genet 1996；5（7）: 933-943

12 Sachdeva K, Saxena R, Majumdar A,et al. Use of ethnicity specific sequence tag site markers for Y chromosome microdeletion studies.Genet Test Mol Biomarkers2011；15（6）: 451-459

13 Feng C, Wang LQ, Dong MY,et al. Assisted reproductive technology may increase clinical mutation detection in male offspring.Fertil Steril2008；90（1）: 92-96

14 邵法明, 朱晓斌, 李铮, 等. 男性不育症ICSI治疗的遗传风险分析. 中华男科学杂志 2008；14（1）: 71-74

（2016-03-20收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.06.010

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*通讯作者，Tel：13315995623；E-mail:779166724@qq.com