siRNA沉默Her-2/neu基因对胰腺癌BXPC-3细胞COX-2表达及细胞生物学行为的影响

2016-01-25霍华治苏春永杨晓光

河北医药 2015年17期

霍华治　苏春永　杨晓光

霍华治苏春永杨晓光

【摘要】目的观察siRNA沉默胰腺癌BXPC-3细胞中Her-2/neu基因对COX-2表达及细胞增殖、凋亡、侵袭力的影响，探讨干扰Her-2/neu抑制BXPC-3生物学行为的可能机制，为胰腺癌的临床治疗提供新的思路。方法采用实时荧光定量PCR法(RT-QPCR)和Western blot检测Her-2/neu、COX-2 mRNA和蛋白在胰腺癌BXPC-3细胞及正常胰腺HPDE6C7细胞的表达。设计并构建Her-2/neu siRNA慢病毒表达载体转染BXPC-3细胞，检测Her-2/neu基因沉默对COX-2 mRNA和蛋白表达的影响。CCK-8法检测Her-2/neu siRNA对细胞增殖的影响。流式细胞仪检测Her-2/ neu siRNA对细胞凋亡的影响。Transwell小室实验检测Her-2/neu siRNA对细胞侵袭力的影响。结果Her-2/neu、COX-2 mRNA和蛋白在胰腺癌细胞中均高表达，而在正常胰腺细胞株中极少表达，差异有统计学意义(P＜0.05)。Her-2/neu基因沉默能显著抑制COX-2 mRNA和蛋白表达，细胞增殖、侵袭能力显著减弱，细胞凋亡率显著增加(P＜0.05)。结论胰腺癌细胞高表达Her-2/neu、COX-2，Her-2/neu基因沉默能够显著抑制细胞增殖和侵袭能力，并促进细胞凋亡。

【关键词】胰腺癌;原癌基因表皮生长因子;环氧合酶2;基因沉默;增殖;凋亡;侵袭

收稿日期:( 2015－03－19) ( 2015－01－27)

11 Genoves M，Van den bosch F，Roberson S，et al.Ly2439821，a humanized anti-interleukin-17 monoclonal antibody，in the treatment of patients with rheumatoid arthritis a phase 1 randomized，double-blind，placebo-controued，proof-of-concept study.Arthritis Rheum，2010，62: 929-939.

10 Bolton CE，Stone MD，Edwards PH，et al.Circulating matrix metallo proteinase-9 and osteoporosis in patients with chronic obstructive pulmonary disease.Chron Respir Dis，2009，6: 81-87.

9 Nyman JS，Lynch CC，Perrien DS，et al.Differential effects between the loss of MMP-2 and MMP-9 on structural and tissue-level properties of bone.J Bone Miner Res，2011，26: 1252-1260.

8 Koenders MI，van den Berg WB.Novel therapeutic targets in rheumatoid arthritis.Trends Pharmacol Sci，2015，36: 89-195.

7 Taneja V.Cytokines pre-determined by genetic factors are involved in pathogenesis of Rheumatoid arthritis.Cytokine，2014，29: 129-130.

6 van Spil WE，DeGroot J，Lems WF，et al.Serum and urinary biochemical markers for knee and hip-osteoarthritis: a systematic review applying the consensus BIPED criteria.Osteoarthritis Cartilage，2010，18: 605-612.

【中图分类号】R 735.9

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2015)17－2579－04

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.17.005

【Abstract】Objective To investigate the specific effect of silencing of Her-2/neu gene by small interfering RNA(siRNA)on COX-2 expression and the cell biological behaviors of human pancreatic cancer cell line BXPC-3 in order to find an new therapeutic method for pancreatic cancer.Methods The expression levels of Her-2/neu，COX-2 mRNA and proteins were detected by RT-QPCR and Western Blot in human pancreatic cancer cell lines BXPC3 and normal pancreas cell line HPDE6C7.The specific Her-2/neu siRNA was synthesized and transfected into BXPC3 cells by lentivirus，and the expression levels of Her-2/neu and COX-2 were detected.The CCK-8 assay was used to analyze the proliferation of BXPC3 cells.Flow cytometry was used to determine the apoptosis of BXPC3 cells.The cell invasion was evaluated by transwell assay.Results The overexpressions of Her-2/neu，COX-2 mRNA and proteins were observed in human pancreatic cancer cell lines BXPC3.However the expressions of Her-2/neu，COX-2 mRNA and proteins were almost not detected in normal pancreas cell line HPDE6C7，there were significant differences between the two kinds of cells(P＜0.05).The Her-2/neu siRNA could remarkedly inhibit the expressions of COX-2 mRNA and proteins.The proliferation and invasiveness of BXPC3 cells in Her-2/ neu siRNA group were decreased obviously.However the apoptosis of BXPC3 cells in Her-2/neu siRNA group was significantly increased(P＜0.05).Conclusion The overexpressions of Her-2/neu and COX-2 are observed in the human pancreatic cancer cell lines BXPC3，moreover，Her-2/neu gene silence can obviously inhibit proliferative and invasive abilities of the cells，furthermore，which can induce apoptosis of BXPC3 cells.

作者单位: 056001河北省邯郸市中心医院胸外科

Effect of Her-2/neu siRNA on COX-2 expression and biological behavior of human pancreatic cancer BXPC-3 cells

HUO Huazhi，SU Yongchun，YANG Xiaoguang.Department of Thoracic Surgery，Handan Municipal Central Hospital，Hebei，Handan 056001，China

【Key words】pancreatic cancer; proto-oncogene epidermal growth factor; cyclooxygease 2; gene silencing; proliferation; apoptosis; invasion

近年来，胰腺癌的发病率和病死率逐年升高，是预后最差的消化道恶性肿瘤之一，该病早期确诊困难，易出现淋巴结转移，手术切除率低，且对放化疗不敏感，术后5年生存率仅为4.1%，预后严重不良［1］。因此，从肿瘤过度增殖、侵袭和转移的分子机制角度寻找有效的阻断靶点对于胰腺癌的临床治疗具有重要指导意义。原癌基因表皮生长因子2(Her-2/neu)是Her-2基因编码的酪氨酸蛋白激酶，属于表皮生长因子受体(EGFR)家族。环氧合酶2(COX-2)是花生四烯酸代谢过程中的限速酶之一，在细胞有丝分裂、细胞粘附、疼痛发生发展等病生理过程中发挥重要调控作用。国内外研究表明，胃癌、乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤组织存在Her-2/neu、COX-2的高表达，与肿瘤发生发展、侵袭转移及血管生成密切相关，可以作为判断肿瘤转移、预后及药物治疗效果的独立标记物［2，3］。

1　材料与方法

1.1主要试剂胰腺癌BXPC-3、PANC、AsPC1细胞购自上海中科院细胞库。兔抗人Her-2/neu、COX-2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。Trizol、Real Time-PCR试剂盒购自美国Promega公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养:在37℃、5% CO2孵箱中用含10%小牛血清的DMEM培养基培养BXPC-3细胞。将对数生长期的细胞接种于培养皿中，调整细胞密度为1× 105/ml，待细胞融合至30%～50%，将细胞分为3组:①空白对照组;②阴性对照组:转染NC-GFP-LV;③转染组:转染Her-2/neu siRNA慢病毒载体。

1.2.2 Real Time-PCR(qPCR):采用Real Time-PCR(qPCR)方法检测胰腺癌细胞及正常胰腺细胞Her-2/ neu、COX-2 mRNA表达水平，参照说明书操作。Gene Bank网站获取Her-2/neu、COX-2基因序列，使用Primer Premier5.0设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成。Trizol提取组织总RNA，将2.0 μg总RNA用于后续的Real Time-PCR反应。PCR扩增完毕后，以GAPDH为内参照基因，目的基因Her-2/neu、COX-2表达的相对定量值(RQ值)用于统计分析。见表1。

表1　Her-2/neu、COX-2及GAPDH引物序列

1.2.3 Western blot:收集并提取细胞总蛋白，BCA法定量蛋白后进行SDS-聚丙酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，特异性一抗4℃孵育过夜，IgG二抗孵育2 h，ECL显色。采用UVP分析软件对目的条带及内参照条带做灰度值分析。

1.2.4 CCK-8实验: 3组细胞用0.25%胰蛋白酶消化后接种于96孔板中，调整细胞密度为1×103/孔。分别于24 h、48 h、72 h、96 h加入CCK-8溶液10 μl，继续培养4 h，在酶标仪450 nm处测定各孔吸光度值，重复3次，取均值。

1.2.5流式细胞术:细胞以4×105/孔接种于6孔板中，不同处理因素处理细胞，培养48 h，待细胞融合至约80%时胰蛋白酶消化收集细胞，用标记荧光素FITC 的Annexin V和PI染色，1 h内检测细胞凋亡率，按照试剂盒说明书操作。

1.2.6 Transwell小室实验: 3组细胞用无血清DMEM清洗2次，调整细胞密度为1×109/L。取100 μl接种于不含基质胶的transwell小室上层，同时在下层加入含有20% FBS的DMEM溶液500 μl做为趋化因子，培养48 h后取出小室，用棉签拭去小室上层细胞，4%多聚甲醛固定，PBS清洗后用0.1%结晶紫染色，200倍倒置显微镜下观察并拍照，随机选取5个视野计数细胞数，取均值进行统计分析。

1.3统计学分析应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1胰腺癌细胞Her-2/neu、COX-2的表达胰腺癌BXPC-3细胞Her-2/neu、COX-2 mRNA的表达与正常胰腺HPDE6C7细胞表达比较，差异均有统计学意义(P＜0.05);胰腺癌BXPC-3细胞Her-2/neu、COX-2蛋白的表达，与正常胰腺HPDE6C7细胞的表达比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。Her-2/neu、COX-2 mRNA和蛋白表达量明显高于正常胰腺HPDE6C7细胞。见表2、3。

表2　Her-2/neu、COX-2在BXPC-3、HPDE6C7细胞中的表达比较±s

注:与HPDE6C7细胞比较，*P＜0.05

蛋白HPDE6C7细胞类别Her-2/neu mRNA 蛋白COX-2 mRNA 0.15±0.02　 0.12±0.02　 0.11±0.01　 0.09±0.01 BXPC-3细胞　2.56±0.41*2.24±0.35*2.29±0.32*　2.03±0.31*

2.2 Her-2/neu siRNA对胰腺癌BXPC-3细胞Her-2/ neu表达的影响RT-QPCR和western blot结果显示，Her-2/neu siRNA转染BXPC-3细胞后Her-2/neu mRNA和蛋白表达量显著降低，与空白对照组和阴性对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。靶向Her-2/neu的siRNA在BXPC-3细胞表达后可以显著抑制Her-2/neu表达。见表4。

表3　Her-2/neu、COX-2在PANC、AsPC1、HPDE6C7细胞中的表达比较±s

注:与HPDE6C7细胞比较，*P＜0.05

类别Her-2/neu mRNA 蛋白COX-2 mRNA 蛋白HPDE6C7细胞0.15±0.02　 0.12±0.02　 0.11±0.01　 0.09±0.01 PANC细胞　2.39±0.38*2.16±0.32*2.31±0.33*　2.10±0.34*AsPC1细胞　2.27±0.35*2.05±0.31*2.42±0.36*　2.19±0.36*

表4　3组Her-2/neu mRNA和蛋白相对表达水平　±s

注:与转染组比较，*P＜0.05

组别Her－2/neu mRNA 蛋白阴性对照组　2.52±0.42*　2.27±0.31*空白对照组　2.58±0.43*　2.30±0.35*转染组0.44±0.07　0.38±0.06

2.3 Her-2/neu siRNA对胰腺癌BXPC-3细胞COX-2表达的影响RT-QPCR和western blot结果显示，Her-2/neu siRNA转染后48 h，COX-2 mRNA和蛋白表达均显著降低，与空白对照组和阴性对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表5。

表5　3组Her-2/neu mRNA和蛋白相对表达水平　±s

注:与转染组比较，*P＜0.05

组别COX-2 mRNA 蛋白阴性对照组　2.34±0.35*　2.20±0.33*空白对照组　2.28±0.33*　2.17±0.34*转染组0.33±0.06　0.21±0.03

2.4 Her-2/neu siRNA对胰腺癌BXPC-3细胞增殖能力的影响CCK-8实验结果表明，Her-2/neu siRNA转染后48 h，BXPC-3细胞增殖能力显著降低，且呈时间依赖性，与空白对照组和阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表6。

表6　Her-2/neu siRNA对胰腺癌BXPC-3细胞增殖能力的影响±s

注:与转染组比较，*P＜0.05

组别A450 24 h　48 h　72 h　96 h阴性对照组　0.37±0.06　 0.49±0.07*　 0.68±0.10*　 0.87±0.14*空白对照组　0.39±0.07　 0.51±0.09*　 0.67±0.11*　 0.89±0.15*转染组0.34±0.05　 0.39±0.06　 0.51±0.08　0.62±0.09

2.5 Her-2/neu siRNA对胰腺癌BXPC-3细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果表明，Her-2/neu siRNA转染后48 h，BXPC-3细胞凋亡率显著增加，且呈时间依赖性，与空白对照组和阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表7。

表7　Her-2/neu siRNA对胰腺癌BXPC-3细胞凋亡的影响%，±s

注:与转染组比较，*P＜0.05

组别凋亡率24 h　48 h　72 h　96 h阴性对照组　2.12±0.35　 2.83±0.42*　 3.12±0.52*　 3.19±0.53*空白对照组　2.15±0.34　 2.81±0.45*　 3.20±0.53*　 3.31±0.55*转染组2.11±0.29　 4.26±0.64　 6.38±0.96　9.11±1.35

2.6 Her-2/neu siRNA对胰腺癌BXPC-3细胞侵袭力的影响Transwell小室实验结果显示，Her-2/neu siRNA转染后48 h，穿膜细胞数显著降低，且呈时间依赖性，与空白对照组和阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表8。

表8　Her-2/neu siRNA对胰腺癌BXPC-3细胞侵袭力的影响

3　讨论

原癌基因Her-2/neu是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，在正常成人组织极少表达，参与调节细胞分裂、生长及分化。而在体内外致癌因素刺激下Her-2/ neu基因发生结构突变，或以基因扩增的方式导致Her-2/neu蛋白过表达，进而影响上皮细胞钙黏蛋白(E-eadherin)、基质金属蛋白酶(MMPs)、血管内皮生长因子(VEGF)等多个靶基因的表达，导致细胞生物学特性的改变，促使细胞异常增殖、侵润和转移，并造成肿瘤细胞的耐药性［4］。研究显示，Her-2/neu在乳腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、骨肉瘤等多种恶性肿瘤组织高表达，其过表达预示着肿瘤恶性程度高、转移能力强、患者预后不良［5，6］。以Her-2/neu基因为靶点的靶向治疗已经广泛应用于乳腺癌和胃癌的临床治疗中，具有抑制肿瘤侵袭转移的治疗效果。我们前期研究也发现，胰腺癌组织Her-2/neu异常高表达，且其表达与胰腺癌临床分期、组织分级、肿瘤浸润转移及一年生存率密切相关［7］。但是有关Her-2/neu在疾病发生发展中的生物学功能和具体的分子调控机制国内报道尚少。因此，检测胰腺癌细胞Her-2/neu表达水平对于了解疾病进展、制定治疗方案及预后评估具有重要指导作用。

COX-2是一种诱导型酶，在正常组织极少表达，而在胃癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、喉癌等恶性肿瘤组织

高表达，预示患者预后不良、生存期短。研究显示，生长因子、炎性因子、缺氧及致癌物质等因素刺激细胞大量表达COX-2，具有诱导细胞恶变、促进肿瘤细胞过度增殖、侵袭和转移、抑制细胞凋亡等作用［3］。而非甾体抗炎药具有抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡的作用，这主要是与它能够有效抑制COX-2有关，提示COX-2有可能成为治疗胰腺癌的潜在靶点。但由于长期服用非甾体抗炎药容易产生心血管不良反应，加之存在一些非COX-2依赖性不良反应因此当前迫切需要研究抑制COX-2的新措施。

Her-2/neu、COX-2在卵巢上皮性癌、涎腺腺样囊性癌等恶性肿瘤组织异常高表达，且二者表达呈正相关，提示Her-2/neu、COX-2相互促进、相互调节，共同参与恶性肿瘤的发生发展。本实验选取胰腺癌BXPC-3细胞为研究对象，采用RNA干扰技术，设计靶向Her-2/neu基因的siRNA，该方法具有特异性、高效、可稳定遗传的优点，能够特异性沉默BXPC-3细胞中Her-2/neu基因表达。结果表明，BXPC-3细胞中Her-2/neu、COX-2均高表达，将Her-2/neu siRNA导入BXPC-3细胞后能够在mRNA和蛋白水平成功抑制Her-2/neu、COX-2的表达。在此基础上，我们分别采用CCK-8实验、流式细胞术、Transwell小室实验检测Her-2/neu siRNA对BXPC-3细胞生物学行为的影响。结果显示，Her-2/neu表达被抑制后，细胞增殖及侵袭力显著下降，细胞凋亡显著增加，提示Her-2/neu siRNA通过抑制其下游靶基因COX-2的表达从而影响BXPC-3细胞的增殖和侵袭能力。Wang等［8］研究显示Her-2/neu通过与COX-2基因启动子结合促进COX-2的转录和表达，与本研究结果一致。COX-2能够上调凋亡抑制因子bcl-2、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMPs)的表达，这可能是Her-2/neu上调COX-2表达最终导致肿瘤细胞异常增殖、浸润和转移的机制之一［9，10］。

综上所述，本研究通过构建靶向Her-2/neu基因的siRNA成功造成胰腺癌BXPC-3细胞中Her-2/neu基因沉默，并显著下调了COX-2的表达水平，证明胰腺癌细胞中Her-2/neu、COX-2表达具有相关性，与文献报道一致。此外，Her-2/neu基因沉默后细胞增殖及侵袭力显著下降，细胞凋亡显著增加，说明Her-2/neu有可能成为胰腺癌基因治疗的潜在靶点，并为RNA干扰技术应用于胰腺癌转移的治疗提供了实验依据。

参考文献

1 Mihaljevic AL，Michalski CW，Friess H，et al.Molecular mechanism of pancreatic cancer-understanding proliferation，invasion，and metastasis.Langenbecks Arch Surg，2010，395: 295-308.

2 Subik K，Lee JF，Baxter L，et al.The Expression Patterns of ER，PP，HER2，CK5/6，EGFR，Ki-67 and AR by immunohistochemical analysis in Breast Cancer Cell Lines.Breast Cancer，2010，20: 35.

3 Menter DG，Schilsky RL，DuBois RN.Cyclooxygenase-2 and cancer treatment: understanding the risk should be worth the reward.Clin Cancer Res，2010，16: 1384-1390.

4 Mittendorf EA，Liu Y，Tucker SL，et al.A novel interaction between HER2/neu and cyclin E in breast cancer.Oncogene，2010，29: 3896.

5 Bolenz C，Shariat SF，Karakiewicz PI，et al.Human epidermal growth factor receptor 2 expression status provides independent prognostic information in patients with urothelial carcinoma of the urinary bladder.Bjuint，2010，106: 1216-1222.

6 Bozzetti C，Negri FV，Lagrasta CA，et al.Comparison of HER2 status in primary and paired metastatic sites of gastric carcinoma.Br J Cancer，2011，104: 1372-1376.

7苏春永，贾军刚，霍华志.胰腺癌组织中Her-2/neu的表达与临床病理因素的关系.河北医药，2013，35: 1291-1293.

8 Wang SC，Lien HC，Xia W，et al.Binding at and transactivation of the Cox-2 promoter by nuclear tyrosine kinase receptor ErbB-2.Cancer Cell，2004，6: 251-261.

9 Li ZR，Li YP，Lin ML，et al.Activated macrophages induce neovascularization through upregulation of MMP-9 and VEGF in rat corneas.Cornea，2012，31: 1028-1035.

10 Scoditti E，Calabriso N，Massaro M，et al.Mediterranean diet polyphenols reduce inflammatory angiogenesis through MMP-9 and COX-2 inhibition in human vascular endothelial cells: a potentially protective mechanism in atherosclerotic vascular disease and cancer.Arch Biochem Biophys，2012，527: 81-89.