贺 喜 岳 龙 张石蕊* 李凤娜 陈达图胡官波 沈 俊 曾建国

(1.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128;2.湖南农业大学兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程研究中心，长沙 410128;3.中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙 410125)

植物源血根碱(以下简称血根碱)是从博落回中提取的一种生物碱，血根碱除了具有生物碱共有的一些特性外［1］，一些学者发现血根碱对色氨酸的代谢有一定的影响。Walterová等［2］研究表明，血根碱影响色氨酸代谢的可能途径在于它们的结构都具有类似的含氮环状结构，均可以结合芳香族氨基酸代谢关键酶，血根碱竞争性抑制色氨酸脱羧酶的活性而减少色氨酸的代谢量。血液是营养物质、代谢产物、激素以及其他物质的转运媒介。猪体循环中，与养分运输有直接关系的循环为门脉循环。消化器官吸收的养分经过门静脉进入肝脏，再加以处理［3］。因此，给猪安装动-静脉血管插管，可以从其血液流速及成分动态变化过程中反映饲粮因子对猪营养状态的影响。本试验通过安装动-静脉血管插管的方法，测定猪门静脉血浆流率(PVPF)、门静脉氨基酸净吸收量和门静脉血浆尿素氮净吸收量等指标，探讨血根碱替代色氨酸对仔猪PVPF及门静脉氨基酸代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物分组

试验选取18头20 kg左右的“杜×长×大”三元杂交公猪，进行血插管手术，待猪恢复正常后选取其中符合试验要求的12头随机分为4个处理，每个处理3头猪。4个处理分别为低蛋白质饲粮组(低蛋白质组)、低蛋白质不补充色氨酸饲粮组(缺色氨酸组)、低蛋白质不补充色氨酸添加血根碱饲粮组(血根碱组)和常规饲粮组。

1.2 血根碱及试验饲粮

1.2.1 血根碱

本试验的血根碱由兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程研究中心提供，稀释浓度为1.5% 。

1.2.2 试验饲粮

根据猪体重，参照NRC(1998)及本团队前期相关研究的氨基酸平衡模式配制饲粮，其中血根碱预混剂的添加量为40 mg/kg。试验饲粮组成及营养水平见表1。

表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.3 仔猪动－静脉插管系统的安装

1.3.1 术前准备

试验猪单笼饲喂于可调节不锈钢代谢笼内，笼内有独立的饮水器和给料器，室温控制在20～22℃。试验前7 d开始饲喂试验饲粮，手术前试验猪禁食12 h，不禁水。手术前应准备好手术需用的器械，药品，人员安排妥当。手术室消毒，室温需保持25℃左右。

1.3.2 动-静脉插管的安装

参照黄瑞林等［4］方法分别在颈动脉、门静脉和肠系膜静脉安装插管。

猪门静脉与肠系膜静脉插管安装:手术前15 min给猪注射阿托品，5 min后将其麻醉并固定于手术台上，同时借助金陵-01型麻醉呼吸机(南京普澳医疗设备有限公司)，用异氟醚通过呼吸道对猪进行全身麻醉，在猪耳静脉滴注葡萄糖生理盐水。术部刮毛，清洗并消毒，纵向切开约10 cm长的切口，分离肌肉，剪开腹膜，找到门静脉并剥离门静脉处血管的浆膜等结缔组织，首先用引导针从后心方向插入门静脉，再将插管插入门静脉血管内，约2 cm深，并确保插管通顺后固定。然后找出回盲瓣，在近回盲瓣的肠系膜处选一根较粗的静脉血管，剥离结缔组织，将插管顺血液回流方向插入，约5 cm深，确保插管通顺后固定。插管安装完毕后，关闭腹膜，缝合肌肉，然后用自制的约20 cm长的牵引针分别将肠系膜插管和门静脉插管通过皮下牵引至肩胛部并穿出体表，插管与牵引针需先用75%的酒精进行消毒处理，最后缝合皮肤。

猪颈动脉插管安装:猪颈部右侧刮毛，清洗并消毒，于喉结处纵向切开约5 cm的切口，钝性分离肌肉和筋膜组织，找到颈动脉，并剥离迷走神经总干及周围组织，游离颈动脉，将离心端结扎，将插管向心方向插入，约10～12 cm深，并固定，缝合肌肉，然后将插管通过皮下牵引至肩胛部穿出体表。缝合皮肤。

1.3.3 术后护理

术后为保护猪不因伤口恢复时痛痒而磨蹭掉插管，应定期向伤口涂抹止痒膏和消炎药，并给猪穿上特制的保护服。术后每天需定时抽出1 mL左右的淤血，并用200 IU/mL肝素钠溶液清洗插管，防止插管堵塞。

1.4 试验操作程序

试验前预饲7 d，饲喂相应试验饲粮，自由采食，记录每天采食量，自由饮水。在第7天从肠系膜静脉处连续灌注对氨基马尿酸(PAH)，然后采集猪动静脉血样。采样当天结束后称猪体重，记录。

1.4.1 PAH 的配制和灌注

PAH的配制和灌注方法参照李铁军等［5］试验方法进行。

1.4.2 采样当天的饲喂方式

参照方正锋等［6］的方法:猪在采样前1 d晚上停止喂食，在采样当天08:00开始第1次饲喂，以后每隔1 h饲喂1次，连续饲喂6次，每次给料量为日采食量的1/24，日采食量按体重的4.5%计算。

1.4.3 血液样品的采集与制备

在第1次饲喂开始前15 min，即采样当天的07:45，采取基线血样。然后从09:00开始每1 h采集1次，连续采集6次(不包括基线血样)。采样方法为:用一次性注射器缓慢均匀地从动静脉插管中抽取血液，从每个插管抽取前的1 mL均丢弃，然后换新注射器抽取血样，将血样放入经400 IU/mL的肝素钠溶液抗凝处理的离心管中，于2 500×g、4℃离心机中离心15 min制备血浆。

1.4.4 PAH 浓度的测定

从1%PAH灌注液(为10 000 mg/L)中移取1 mL，用双蒸水定溶至100 mL(为100 mg/L)，再从 100 mL PAH 溶液中分别移取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 和 1.0 mL PAH，按顺序分别加入2 mL的NaNO2溶液、氨基磺酸铵溶液和N-1-萘乙二胺盐酸盐溶液，用双蒸水定溶至50 mL，其 PAH 浓度则分别为 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 和 2.0 mg/L，然后用Multiskan型酶标仪于波长550 nm处测吸光度(A)。

分别取猪动-静脉血浆1 mL，置于50 mL容量瓶中，按顺序分别加入2 mL的NaNO2溶液、氨基磺酸铵溶液和N-1-萘乙二胺盐酸盐溶液，用双蒸水定溶至50 mL，然后用Multiskan型酶标仪于波长550 nm处测定吸光度(A)，根据标准浓度方程计算样品的PAH浓度。

1.5 计算公式

根据下面3个公式，计算出PVPF，门静脉氨基酸净吸收量和门静脉血浆尿素净吸收量。

其中，CPAH为血浆中PAH的浓度;APAH为血浆中PAH吸光度;a和b为PAH标准溶液所测系数。

其中，PVPF为门静脉血浆流率［mL/(min·kg BW)］;Ci为 PAH 灌注液浓度(mg/mL);IR为PAH灌注流速(mL/min);PAHpv和PAHa分别为门静脉与颈动脉血浆中PAH浓度(mg/mL);BW为采样当天试验猪体重。

其中，q为短时间内(当dt在5 min内，时间因素dt可以考虑为常数)某营养物质吸收的量;Cp和Ca分别为门静脉与颈动脉某营养物质的量;D为PVPE;Q为采食后在时间T0与t1之间某营养物质吸收的量，但这一吸收量不包含营养物质总的吸收量，仅为门静脉血液某营养物质的净吸收量。

1.6 数据分析

采用SPSS 17.0统计软件，对所有数据进行统计分析，表中数据用平均值±标准差表示，差异显著性用Duncan氏法统计方法进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 猪PVPF的测定结果

从表2可以看出，缺色氨酸组6 h内PVPF平均比低蛋白质组、血根碱组、常规饲粮组分别低5.13%、4.36%、8.92%，但差异不显著(P＞0.05)。同一试验组不同时间段的PVPF结果显示，低蛋白质组和缺色氨酸组的PVPF采食前到采食后6 h呈上升趋势，各点间差异不显著(P＞0.05)，血根碱组的PVPF呈上升趋势，5 h的PVPF显著高于前4 h(P＜0.05)，并在6 h达到最高值，且显著高于5 h(P＜0.05)。常规饲粮组的 PVPF采食后1 h的PVPF显著低于后面5个时间段(P＜0.05)。同一时间点不同试验组PVPF结果显示，在采食1 h血根碱组的PVPF显著高于低蛋白质组(P＜0.05)，与缺色氨酸组和常规饲粮间差异不显著(P＞0.05);采食2 h缺色氨酸组的 PVPF比低蛋白质组和血根碱组低6.84%和6.68%(P＞0.05)，比常规饲粮组低 15.82%(P＜0.05)。上述结果表明猪PVPF会随着采食时间变化而呈上升的趋势，总体水平不随饲粮变化而变化。

表2 食后不同时间点PVPF变化情况Table 2 Post-prandial PVPF of piglets at different time mL/(min·kg BW)

2.2 猪采食后6 h内门静脉氨基酸净吸收量

从表3可以看出，缺色氨酸组门静脉赖氨酸、色氨酸及精氨酸净吸收量显著低于蛋白质组、血根碱组和常规饲粮组(P＜0.05)，而低蛋白质组、血根碱组和常规饲粮组间门静脉赖氨酸、色氨酸及精氨酸净吸收量差异不显著(P＞0.05)。缺色氨酸组门静脉必需氨基酸及总氨基酸净吸收量显著低于蛋白质组、血根碱组和常规饲粮组(P＜0.05)，而低蛋白质组和血根碱组间门静脉必需氨基酸及总氨基酸净吸收量差异不显著(P＞0.05)。上述结果说明在低蛋白质饲粮中不添加色氨酸，氨基酸不平衡时，其门静脉必需氨基酸与总氨基酸净吸收量受到影响，添加血根碱替代色氨酸，能一定程度改善门静脉必需氨基酸和总氨基酸的净吸收量。

表3 试验猪6 h内门静脉氨基酸净吸收量Table 3 The levels of amino acids net absorption in portal vein post-prandial 6 hours %

2.3 猪门静脉血浆尿素氮净吸收量

从表4可以看出，缺色氨酸组门静脉血浆尿素氮净吸收量比低蛋白质组和血根碱组高0.02%和1.97%，比常规饲粮组低3.80%，差异不显著(P＞0.05)。结果说明在低蛋白质饲粮基础上，添加色氨酸、不添加色氨酸或血根碱替代色氨酸条件下动物机体对血液中氮元素吸收量相近，常规饲粮亦如此。

表4 试验猪6 h内血浆尿素氮净吸收量Table 4 The levels of plasma UN net absorption in portal vein post-prandial 6 hours mmol/g

3 讨论

3.1 血根碱对PVPF的影响

有关猪PVPF的研究较少。方正锋等［6］研究表明，仔猪采食1 h内血流速度快速上升，2～5 h趋于平稳，在6 h达到最高值。另据资料报道［7］，尽管PVPE在采食前后各时间点的流率有所不同，呈下降趋势，但其不随饲粮的变化而发生较大的改变。本试验研究表明，各组的PVPE在采食前后各时间点的流率都有所不同，整体呈上升趋势，后期较缓。相对于不补充色氨酸组，添加血根碱后，对PVPF有一定提高。结果表明添加血根碱对猪PVPF有一定影响。

3.2 血根碱对猪6 h内血浆氨基酸净吸收量和尿素氮净吸收量的影响

动物的生长主要表现在蛋白质的沉积，而蛋白质沉积取决于门静脉净吸收的必需氨基酸量［8］。Yin 等［3］研究表明，猪饲粮中被消化吸收的氨基酸，仅有50% ～60%出现在门静脉中供外周组织蛋白质合成，其余则被门静脉回流组织本身所利用。本试验结果显示低蛋白质饲粮补充色氨酸和不补充色氨酸比较，6 h内必需氨基酸和总氨基酸净吸收量均以低蛋白质补充色氨酸组高于不补充色氨酸组。说明在色氨酸不能满足的条件下会降低猪对饲粮必需氨基酸和总氨基酸的净吸收量。血根碱替代色氨酸后，6 h内必需氨基酸净吸收量和总氨基酸净吸收量与低蛋白质饲粮组基本相近，说明用血根碱替代色氨酸后动物机体能在一定程度上影响色氨酸的代谢，从而影响必需氨基酸和总氨基酸的代谢。Walterová等［2］研究表明，血根碱与色氨酸结构相似，具有类似的含氮环状结构，可以竞争性结合肠道芳香族氨基酸代谢关键酶，这也许是血根碱影响色氨酸代谢的原因之一。

尿素氮是衡量猪体内氮平衡的一个重要指标。本研究门静脉血浆尿素氮净吸收量结果表明，在低蛋白质饲粮基础上，添加色氨酸、不添加色氨酸或血根碱替代色氨酸条件下动物机体对血液中氮元素吸收量相近，说明血根碱不会影响猪体氮平衡。

4 结论

在低蛋白质饲粮基础上，不补充色氨酸添加血根碱后会相对提高PVPF，增加门静脉总氨基酸和必需氨基酸净吸收量，不影响门静脉血浆尿素氮净吸收量。

［1］ 罗国富，肖世玖.血根碱的药理作用及其应用［J］.兽药与饲料添加剂，2009，14(5):22-24.

［2］ WALTEROVÁ D，ULRICHOVÁ J，VÁLKA I，et al.Benzo［c］phenanthridine alkaloids sanguinarine and chelerythrine:biological activities and dental care applications［J］.Acta Universitatis Palackianae Olomucensis Facultatis Medicae，1995，139:7-16.

［3］ YIN Y L，HUANG R L，LIBAO-MERCADO A J.Net portal appearance of amino acids and glucose，and energy expenditure by portal vein-drained organs in growing pigs fed casein and cornstarch based diets ora wheat shorts based diet［C］//9th Symposium on Digestive Physiology in Pigs.Albert，Canada，2003:340-342.

［4］ 黄瑞林，印遇龙，李铁军，等.用于营养物质代谢的猪动静脉插管技术的研究.Ⅰ.插管及血流量计安装手术［J］.中国兽医杂志，2003，39(6):19-20.

［5］ 李铁军，印遇龙，黄瑞林，等.用于营养物质代谢的猪动静脉插管技术的研究.Ⅱ.门静脉营养物质净流量测定方法［J］.中国畜牧杂志，2003，39(2):28-29.

［6］ 方正锋，彭建，齐智利，等.肠道营养物质代谢的仔猪动-静脉插管技术的建立［J］.中国兽医学报，2010，30(8):1098-1101.

［7］ 李铁军，黄瑞林，印遇龙.不同日粮对猪血液红细胞压容积及其血流量的影响［J］.广西农业生物科学，2003，22(3):159-164.

［8］ 印遇龙.猪氨基酸营养与代谢［M］.北京:科学出版社，2008:147-149.