王丽萍，丁 一，刘国红，石 卓

1)郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室 郑州450001 2)吉林大学基础医学院药理学教研室 长春130021

△女，1977年9月生，硕士，讲师，研究方向:肿瘤药理学，E-mail:lp．wang918@126．com

纤维肉瘤是一种最常见的恶性骨肿瘤，目前临床上主要采用手术治疗，但纤维肉瘤具有手术切除后易复发等缺点。药物治疗在纤维肉瘤的治疗中也具有重要作用。五倍子酸(gallic acid，GA)是一种广泛存在于植物中的多酚类化合物［1］，有学者［2-3］已证实其具有较广泛的药理作用，在抗肿瘤方面的作用逐渐引起人们的关注。目前，GA 抗纤维肉瘤的作用尚无相关报道。作者以人纤维肉瘤HT1080细胞为实验材料，应用MTT 及流式细胞术观察GA对HT1080 细胞增殖及凋亡的影响，应用免疫组化技术观察其对Bcl-2 和Bax 蛋白表达的影响，探索GA 抗肿瘤作用的可能机制。

1 材料与方法

1．1 材料 HT1080 细胞株购自吉林省肿瘤研究所，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM 培养液传代培养，待细胞生长到对数生长期时使用。GA 购自Sigma 公司，用二甲基亚砜(DMSO)溶解。MTT 购自Sigma 公司，胎牛血清购自杭州四季青生物公司，青霉素、链霉素和DMEM 培养基购自Gibco 公司。

1．2 GA 体外对HT1080 细胞生长抑制作用的MTT 法测定 取处于对数生长期的HT1080 细胞，调整密度为1 ×105mL－1，接种于96 孔细胞培养板，24 h 后，分别加入不同质量浓度的药物，使其终质量浓度分别为3．125、6．250、12．500、25．000、50．000和100．000 mg/L，另设只加培养液的空白对照组;每组3 复孔，置37℃、体积分数5% CO2和100%湿度的培养箱中培养48 h。每孔加入5 g/L 的MTT溶液20 μL，继续培养4 h。每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min。酶标仪570 nm 波长处测各孔吸光度(A)值，按下式计算细胞抑制率:细胞抑制率=(1 －A给药孔/A对照孔)×100%。

1．3 GA 体外对HT1080 细胞凋亡的影响 接种对数生长期的HT1080 细胞于6 孔板中，培养24 h，加入GA，使其终质量浓度分别为6．250、12．500 和25．000 mg/L，以只加培养液的为对照组。培养48 h，收集细胞，离心，弃上清。PBS 离心，洗涤2次。加入体积分数70%冷乙醇4℃固定12 h，离心洗涤后，加入200 μL PI 染液、50 μL RNA 酶，4℃避光放置20～30 min，1 500 r/min 离心5 min，调整细胞密度为(1～10)×105mL－1，上流式细胞仪进行分析。

1．4 GA 体外对HT1080 细胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表达的影响 将HT1080 细胞培养在内有洁净盖玻片的6 孔板中，制备细胞爬片。待其生长到对数生长期时，实验组用质量浓度分别为6．250、12．500 和25．000 mg/L 的GA 处理，每组均设10个复孔。作用48 h 后，按说明书进行Bcl-2 和Bax 免疫细胞化学染色，以PBS 代替一抗作阴性对照，一抗均按1∶200稀释，DAB 显色。Bcl-2 和Bax 蛋白阳性信号呈棕黄色颗粒样物质，定位于细胞质或细胞膜。免疫细胞化学结果的判定:观察10个高倍视野，按阳性细胞数＜10%、10%～、30%～和70%～分别计为1、2、3、4 分;按着色强度:胞质内可见浅色颗粒、明显高于背景底色计为1 分，胞质内见较深颗粒计为2 分，胞质内有大量深色颗粒为3 分。上述两种计分的乘积为最后得分。

1．5 统计学处理 采用SPSS 15．0 进行分析。应用单因素方差分析及Dunnet t 检验比较各组细胞抑制率、凋亡率及Bcl-2 和Bax 蛋白表达的差异，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 GA 对HT1080 细胞的生长抑制作用 不同质量浓度(3．125、6．250、12．500、25．000、50．000 和100．000 mg/L)的GA 对HT1080 细胞增殖的抑制率分别为(38．68 ± 3．78)%、(49．87 ± 2．62)%、(61．93 ±4．16)%、(68．34 ± 1．91)%、(76．30 ±3．39)%和(80．20 ±2．12)%，其对HT1080 细胞以剂量依赖的方式抑制其增殖(F = 71．214，P＜0．001)。

2．2 GA 对HT1080 细胞凋亡的影响 随着GA 质量浓度(0．000、6．250、12．500 和25．000 mg/L)的增加，HT1080 细胞的凋亡率增加［(1．57 ±0．72)%、(11．54 ±2．25)%、(25．46 ±1．14)%和(29．35 ±3．27)%］(F=52．217，P＜0．001)。

2．3 各组细胞Bcl-2 和Bax 蛋白的表达 见图1、2和表1。与对照组相比，6．250、12．500 和25．000 mg/L GA组Bcl-2 蛋白表达均减弱，而Bax 蛋白的表达均增强。

图1 GA 作用HT1080 细胞48 h 后免疫细胞化学方法显示Bcl-2 蛋白表达变化(×200)

图2 GA 作用HT1080 细胞48 h 后免疫细胞化学法显示Bax 蛋白表达变化(×200)

表1 4组细胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表达的比较

3 讨论

细胞凋亡是一种主动的受基因调控的细胞自杀过程。bcl-2 家族是目前研究最深入的凋亡调控基因，其中bcl-2 和bax 在决定凋亡与否的过程中发挥着至关重要的作用［4-6］。bcl-2 是凋亡抑制基因，bax基因作为bcl-2 基因家族的成员，表达的Bax 蛋白与Bcl-2 蛋白以异源二聚体形式存在，它的生物学效应主要是拮抗Bcl-2，促进细胞凋亡的发生。Bcl-2 蛋白家族成员抑制细胞凋亡的功能，使细胞凋亡和存活达到一个相对平衡状态。Bax 的高表达、Bcl-2 的低表达作用于线粒体，导致线粒体膜通透性转运孔开放，外膜破坏引起线粒体膜通透性增加，细胞色素C、Smac 等凋亡相关分子大量释放到细胞质，可以活化Caspase-9，再引起下游的Caspase-3 激活，引起细胞凋亡［7-9］。

研究［10］报道GA 有诱导4种人肺肿瘤细胞(小细胞瘤SBC-3 细胞、鳞状细胞癌EBC-1 细胞、腺癌A549 细胞和耐顺铂亚克隆小细胞癌SBC-3/CDDP细胞)凋亡的作用，并且GA 诱导细胞凋亡的敏感性不随顺铂耐药性而改变。还有学者［11］发现GA 对卵巢癌SKOV3 细胞具有明显的增殖抑制作用，并可诱导其凋亡。作者［12］的研究显示在同等剂量下GA的抑瘤效应不如环磷酰胺，但与环磷酰胺相比，GA有两个优点:一方面GA 对肿瘤细胞具有选择性，另一方面GA 对动物的整体毒性低。这些特点均显示了GA 作为抗肿瘤药物的良好应用前景。

该实验在前期工作的基础上，以人纤维肉瘤HT1080 细胞为对象，探讨GA 是否能够在体外抑制HT1080 细胞的生长，以及抑制其生长的可能机制。MTT 结果表明，GA 具有体外抑制HT1080 细胞生长的作用。流式细胞术检测结果显示随着GA 质量浓度的增高，HT1080 细胞的凋亡率也增高，提示GA可能是通过诱导HT1080 细胞的凋亡来抑制其增殖。进一步应用免疫细胞化学方法检测凋亡蛋白Bax 和Bcl-2 的表达，结果显示:与对照组相比，应用GA组Bax 蛋白的表达增强，而Bcl-2 蛋白的表达减少。

综上所述，GA 在体外具有较好的抑制人纤维肉瘤HT1080 细胞生长的作用，GA 可能通过上调Bax 和下调Bcl-2 的表达，介导其诱导的HT1080 细胞凋亡。作者的实验结果为GA 的应用提供了一定的实验资料，但体外实验无法预测GA 在体内的作用，因此还需要从动物体内实验及临床流行病学等方面进一步研究。

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［12］王丽萍，曾宪旭，牛凤兰，等．五倍子酸对小鼠胃癌MFC和肝癌H22 细胞增殖的抑制作用［J］．郑州大学学报:医学版，2012，47(3):339