李 敏，李新强，付琳琳，吴 余，王 虹，唐小燕，付素珍#

1)新乡医学院第一附属医院儿内科 卫辉453100 2)新乡医学院病理学教研室 新乡453003

肾脏纤维化是所有慢性肾脏疾病发展至肾功能衰竭的共同通路，其中肾小管-肾间质纤维化以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积为主要病理特征［1］。肾小管上皮细胞-间充质转分化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)与肾小管-肾间质纤维化密切相关。转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)在肾小管上皮细胞EMT 过程中发挥重要作用，是目前公认的有效的促纤维化因子［2］。因此，抑制TGF-β1 的表达对于防治肾小管-肾间质纤维化具有重要意义。作者拟覆盖TGF-β1 基因cDNA 全长，设计和筛选靶向沉默TGF-β1 表达的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，以期为进一步研究参与TGF-β1 诱导肾小管-肾间质纤维化的下游分子奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料 人肾小管上皮细胞株HKC 购自中国医学科学院细胞库，p-Genesil-1 空载质粒和E．coli DH 5α 大肠杆菌为新乡医学院病理学教研室保存，BamHⅠ限制性内切酶、HindⅢ限制性内切酶、SalⅠ限制性内切酶、T4 DNA 连接酶均为大连TaKaRa 公司产品，D-葡萄糖为美国Aladdin 公司产品，兔抗TGF-β1 多克隆抗体为美国Abcam 公司产品，鼠抗人β-actin 单克隆抗体、辣根酶标记的山羊抗兔和辣根酶标记的兔抗鼠二抗为美国Santa Cruz 公司产品，增强化学发光试剂盒为武汉博士德公司产品。

1．2 靶向沉默TGF-β1 表达的shRNA 的设计和制备 按照siRNA 设计原则，覆盖TGF-β1 基因cDNA全长，设计靶向沉默TGF-β1 的shRNA 5 条(表1)，并进行同源性分析。shRNA 的DNA 序列送大连TaKaRa 公司合成并退火。

1．3 靶向沉默TGF-β1 表达的shRNA 真核重组表达质粒的构建及鉴定 构建含沉默TGF-β1 shRNA的p-Genesil-shRNA 真核表达重组质粒及含无关shRNA 的p-Genesil-1-shRNA-vect 重组质粒。将目的片段shRNA 和质粒载体p-Genesil-1 在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜，将连接产物转化入DH5α 感受态细胞中，37℃培养箱培养18 h 后挑取单克隆，37℃摇床过夜振摇扩增，取1 mL 菌液送大连TaKaRa 公司测序鉴定;菌液中提取质粒行SalⅠ酶切鉴定，质粒p-Genesil-1 的多克隆位点如下:-XbaⅠ-SalⅠ-EcoRⅠ-U6 Promotor-BamHⅠ-shRNA-HindⅢ-;在插入的shRNA 的3'端设计了一个SalⅠ的酶切位点GTCGAC(表1)，若插入正确，SalⅠ单酶切时可切出一条约400 bp 的DNA 条带。

1．4 质粒的转染 以肾小管上皮细胞HKC 为研究对象，常规培养高糖(0．5 mol/L)或Ang Ⅱ(10－3mol/L)刺激的HKC 至对数生长期时，按Invitrogen公司Lipofectamine 2000 说明书进行质粒转染，转染8 h 后，去除含有转染混合物的培养基，换成新鲜的细胞生长培养基，48 h 后用G418 进行筛选，筛选后扩增细胞并进行后续实验。转入p-Genesil-shRNA 1～5重组质粒及p-Genesil-1-shRNA-vect 质粒的细胞分别命名为p-Genesil-shRNA1～5 细胞和p-Genesil-1-vect 细胞。

1．5 高糖刺激后各组细胞中TGF-β1 表达的Western blot 检测 收集HKC 细胞及高糖或AngⅡ刺激的HKC 细胞、p-Genesil-1-vect 细胞和各组p-Genesil-shRNA 细胞，提取细胞总蛋白，并按Bradford方法进行定量，变性处理后进行SDS-PAGE 电泳和转膜，50 g/L 脱脂牛奶封闭，室温2 h，一抗室温摇育2 h，二抗室温摇育2 h，按照增强化学发光试剂盒操作步骤进行显色、曝光，最后显影、定影、扫描。以β-actin 为内参照，蛋白上样量均为150 μg，鼠抗人β-actin 单克隆抗体、兔抗TGF-β1 多克隆抗体、辣根酶标记的山羊抗兔和辣根酶标记的兔抗鼠二抗的稀释度分别为1 ∶1 000、1 ∶300、1 ∶5 000 和1∶5 000。通过Quantity one 软件分析Western blot目的条带与内参照条带的灰度比值。每组均设5个平行对照组。

表1 靶向沉默TGF-β1 表达的shRNA 序列

1．6 统计学处理 采用SPSS 16．0 进行分析。应用单因素方差分析和LSD-t 检验比较高糖刺激或Ang Ⅱ刺激后各组细胞中TGF-β1 表达的差异，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 靶向沉默TGF-β1 表达的shRNA 真核表达重组质粒的鉴定 见图1。构建的p-Genesil-shRNA1、2、3、4 和5 真核表达重组质粒通过SalⅠ酶切鉴定结果显示5个shRNA 重组质粒均可切出与预计相符的400 bp 的片段。测序结果也显示所有重组质粒中，目的片段插入位点和方向正确，无碱基突变、插入、丢失，与实验设计相一致。

图1 靶向沉默TGF-β1 表达的shRNA 真核表达重组质粒酶切鉴定结果

2．2 靶向沉默TGF-β1 表达的shRNA 的筛选 见图2、3 和表2、3。Western blot 结果显示:与HKC 细胞相比，高糖或Ang Ⅱ刺激的HKC 细胞和p-Genesil-1-vect 细胞中TGF-β1 表达均增高，高糖或AngⅡ刺激的HKC 细胞和p-Genesil-1-vect 细胞中TGFβ1 表达差异无统计学意义。与高糖或Ang Ⅱ刺激的p-Genesil-1-vect 细胞相比，高糖或Ang Ⅱ刺激的各组p-Genesil-shRNA 细胞中TGF-β1 表达均降低。

图2 高糖刺激时各组细胞中TGF-β1 表达的Western blot 检测

图3 Ang Ⅱ刺激时各组细胞中TGF-β1 表达的Western blot 检测

表2 高糖刺激时各组细胞中TGF-β1 表达的Western blot 检测结果(n=5)

表3 Ang Ⅱ刺激时各组细胞中TGF-β1 表达的Western blot 检测结果(n=5)

3 讨论

EMT 在肾小管-肾间质纤维化中发挥重要作用，其发生发展受TGF-β/Smad 多条信号传导途径的调控;TGF-β1 是最为关键的促纤维化生长因子，有研究［3］报道TGF-β1 在肾脏纤维化进展过程中发挥了重要作用。TGF-β1 主要在肾脏中表达，由肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞等多种细胞合成和分泌，它不仅可以诱导多种ECM 成分的表达，而且可以通过减少蛋白酶及其激活物的表达，如基质金属蛋白酶，增加蛋白酶抑制剂以及金属蛋白酶组织抑制剂来抑制ECM 的降解。另外，TGF-β1 还是强大的免疫调节因子，对巨噬细胞等有强大的趋化作用。因此，TGF-β1 不仅对肾脏纤维化形成过程有重要作用，而且对慢性炎症的发生发展也可能产生潜在性的影响。因此，沉默TGF-β1 的表达有可能阻断、逆转或至少延缓肾脏纤维化的发生［4-7］，有利于对肾脏纤维化发病机制和治疗策略进行深入的研究。因此，为了研究参与TGF-β1 诱导肾小管-肾间质纤维化的下游分子，该研究对靶向沉默TGF-β1 表达的方法进行了探索。

随着RNA 干扰(RNA interference，RNAi)技术在基因功能、肿瘤等研究中的广泛应用［8-9］，以DNA为模板胞内合成shRNA 表达载体的RNAi 技术为研究提供了更为简便和实用的方法。shRNA 表达载体导入细胞中后，经过细胞内酶切机制形成siRNA，从而使靶基因沉默数周甚至数月。到目前为止，仅有学者［10］通过siRNA 沉默TGF-β1，观察了其对大鼠系膜细胞纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原的影响，未见以肾小管上皮细胞为研究对象的siRNA 沉默TGFβ1 的相关报道。因此，该研究覆盖TGF-β1 基因cDNA 全长，设计和制备了靶向沉默TGF-β1 的5 条shRNA，并构建和鉴定了含TGF-β1 shRNA 的p-Genesil-shRNA 真核表达重组质粒。

该研究进结果显示，与HKC 细胞相比，高糖或AngⅡ刺激的HKC 细胞和p-Genesil-1-vect 细胞中TGF-β1 表达均增高，而后二者之间TGF-β1 表达差异无统计学意义;与高糖或AngⅡ刺激的p-Genesil-1-vect 细胞相比，高糖或AngⅡ刺激的各组p-Genesil-shRNA 细胞中TGF-β1 表达均降低。

综上所述，作者筛选出1 条可靶向沉默TGF-β1表达的shRNA，为进一步研究参与TGF-β1 诱导肾小管-肾间质纤维化的下游分子奠定了基础。

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