任京力，林 玲，王雁梅，王福青，李超彦，蔡智慧，常全忠

1)漯河医学高等专科学校药学系药理学教研室 漯河462002 2)漯河医学高等专科学校基础部生理学教研室 漯河462002 3)遵义医学院珠海校区生理学教研室 珠海519041

缺血性脑损伤是一种严重危害人类健康的疾病，具有较高的发病率、致残率和病死率。缺血中心区神经元的坏死是不可挽救的死亡形式，而缺血周边区神经元的凋亡是一种受程序控制的主动死亡形式，阐明凋亡机制并寻找有效的靶点拮抗药物显得十分重要。氯离子的活动可能参与了缺血性脑损伤神经元凋亡的过程，4，4'-二异硫氰基芪-2，2'-二磺酸(4，4'-diisothiocyanostibibene-2，2'-disulfonic acid，DIDS)作为一种氯离子通道阻断剂可以拮抗离体神经元的凋亡［1-3］。为进一步探讨DIDS 的抗凋亡机制，作者利用H2O2诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株PC12 细胞凋亡，观察DIDS 对细胞凋亡的影响，报道如下。

1 材料与方法

1．1 试剂与仪器 DMEM/F12 基础培养基、H2O2购自Gibco 公司，Bcl-2 抗体、Caspase-3 多克隆抗体购自Sigma 公司。倒置荧光显微镜(奥林巴斯2X71)，二氧化碳培养箱(上海力申科学仪器有限公司)，蛋白电泳及转膜电泳装置(北京六一仪器厂)，流式细胞仪(美国BD FACSCALIBUR)。

1．2 实验分组 高分化PC12 细胞株购于中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。参考文献［4］，取对数生长期的细胞，随机分为9组。对照组细胞常规培养12 h;余8组细胞分别用400 nmol/L H2O2与0(模型组)、5、10、50、100、200、300、400 μmol/L DIDS 培养。培养12 h 后，收集各组细胞，测定细胞存活率，选取最佳DIDS 浓度组进行相关指标的检测。

1．3 MTT 法测定细胞存活率 具体操作参照文献［5-6］。细胞存活率=(吸光度实验组－吸光度空白)/(吸光度对照组－吸光度空白)×100%。

1．4 Western blot 法检测Caspase-3 和Bcl-2 蛋白参照文献［6-7］。取对照组、模型组和100 μmol/L DIDS组细胞，用冰冷的0．1 mol/L PBS 洗涤2次，加裂解液收集细胞，低温离心，收取上清液测定蛋白浓度并用上样缓冲液调整，煮沸10 min 后加样，SDSPAGE 电泳，PVDF 膜转移，胎牛血清封闭液封闭，加Caspase-3 多克隆抗体(1∶1 000)和Bcl-2 单克隆抗体(1∶800)，4℃过夜，加HRP 标记的羊抗兔IgG室温反应2 h 后，ECL 显影。以β-actin 为内参。Western blot 结果用Quantity One 定量分析软件进行分析。目的蛋白相对表达量=目的条带灰度值/βactin 条带灰度值。

1．5 凋亡率的检测 参照文献［8］。取对照组、模型组和100 μmol/L DIDS组细胞，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化，500 r/min 离心，PBS 清洗，离心后收集细胞，用Binding buffer 悬浮细胞，加入Annexin VFITC 混匀后再加入5 μL 碘化丙啶，室温避光反应15 min，上流式细胞仪检测。激发波长488 nm，发射波长530 nm。

1．6 统计学处理 采用SPSS 16．0 进行统计学分析，组间细胞存活率、凋亡率、Caspase-3 和Bcl-2 蛋白相对表达量的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 各组细胞存活率的比较 见表1。结果显示，400 nmol/L H2O2可以明显诱导PC12 细胞损伤，细胞存活率仅35．07%;DIDS 对H2O2诱导的PC12 细胞损伤具有拮抗作用，且具有一定的浓度依赖性。

表1 各组细胞存活率的比较

2．2 对照组、模型组和100 μmol/L DIDS组细胞Caspase-3 和Bcl-2 蛋白表达的比较 见图1、表2。结果显示，模型组Caspase-3 蛋白表达较对照组明显增强，Bcl-2 蛋白表达较对照组明显减弱;而与模型组比较，100 μmol/L DIDS组Caspase-3 表达减弱，Bcl-2 蛋白表达明显增强。

图1 3组细胞Caspase-3、Bcl-2 蛋白的Western blot 检测

2．3 对照组、模型组和100 μmol/L DIDS组细胞凋亡率的比较 见表2。结果显示，与对照组比较，模型组和100 μmol/L DIDS组细胞凋亡率均增加，但100 μmol/L DIDS组细胞凋亡率较模型组明显降低。

表2 3组细胞Caspase-3、Bcl-2 蛋白表达及凋亡率的比较

3 讨论

PC12 细胞株是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，具有神经细胞的一般特征，因其具有可传代的特点，故广泛应用于神经生理和神经药理学研究［9］。该实验选用的是高分化PC12 细胞株。H2O2是一种常用的诱导细胞凋亡的化学试剂，该实验参考文献［4］并结合预实验结果，选用400 nmol/L H2O2诱导细胞凋亡。

DIDS 是一种芪衍生物，是一种阴离子通道阻断剂，对氯离子通道具有非特异性的阻断作用［10］。有资料［11］显示，DIDS 对NO 诱导的离体大鼠海马神经元凋亡具有一定的保护作用，但机制尚不清楚。该实验结果显示，DIDS 对H2O2诱导的PC12 细胞凋亡具有浓度依赖性拮抗作用。Caspase-3 和Bcl-2 是与细胞凋亡有直接关系的凋亡蛋白分子。活性Caspase-3 蛋白具有促进细胞凋亡的作用，正常情况下在细胞内很少被激活。Bcl-2 蛋白是一种抗凋亡蛋白［12-13］。该实验结果显示，DIDS组细胞Caspase-3 表达较模型组明显降低，Bcl-2 蛋白表达升高，提示DIDS 具有拮抗H2O2诱导的PC12 细胞凋亡的作用。据此作者推测，DIDS 可能通过Caspase-3 依赖性信号通路发挥抗凋亡作用。氯通道可能参与了H2O2诱导的PC12 细胞的凋亡［3］。氯通道蛋白与凋亡信号通路之间的联系有待于进一步研究。

［1］李曦，尹金宝，钟志超，等．DIDS 对SIN-1 诱导大鼠海马神经元凋亡及PARP-1/AIF 表达的影响［J］．中国药理学通报，2012，28(11):1549

［2］钟志超，范红领，尹金宝，等．氯通道电流在离体大鼠海马神经元凋亡中变化及SITS 的拮抗作用［J］．郑州大学学报:医学版，2011，46(3):367

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［5］常全忠，张淑玲，尹金宝．电压依赖性氯通道在3-吗啉斯德酮亚胺诱导的大鼠海马神经元凋亡中的作用［J］．中国药理学与毒理学杂志，2010，24(1):8

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［11］Chang QZ，Zhang SL，Yin JB．Role of chloride channels in nitric oxide-induced rat hippocampal neuronal apoptosis in vitro［J］．Neural Regen Res，2010，5(9):690

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