曾敏，邓丽瑜，汤新，刘刚，余少文，*

（1.深圳大学生命科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060；2.深圳大学生命科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，广东深圳518060）

CBHⅡ和EGⅣ的重构基因在里氏木霉中的组成型表达

曾敏1，2，邓丽瑜1，汤新1，刘刚1，余少文1，*

（1.深圳大学生命科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060；2.深圳大学生命科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，广东深圳518060）

重构基因cbh2-linker-CDeg4表达的融合蛋白同时获得具有外切葡聚糖酶CBH II和内切葡聚糖酶EG IV 2种催化活性，在纤维素降解等方面有着重要应用。本研究通过overlap PCR将里氏木霉丙酮酸脱羧酶（PDC）的启动子、纤维二糖水解酶cbh1的信号肽、重构基因cbh2-linker-CDeg4和pdc终止子依次连接，以质粒pPICZαA为基本骨架，构建表达载体pPIC-PCT。采用原生质体转化法将pPIC-PCT和含潮霉素抗性筛选标记的质粒pAN7-1共转里氏木霉。SDS-PAGE分析表明，重构基因cbh2-linker-CDeg4实现了在里氏木霉中的组成型表达，测得重组木霉发酵上清液的CMCNa酶活最高达到4.08 U/mL，是出发菌株的5.55倍，FPA酶活达到0.915 U/mL，较出发菌株提高了43.6%。酶学性质初步研究表明：粗酶液的最适pH为5.0，最适温度为50℃。

基因重构；外切葡聚糖酶Ⅱ；内切葡聚糖酶Ⅳ；丙酮酸脱羧酶启动子

纤维素酶能有效降解纤维素，将其水解成葡萄糖，广泛应用于纺织、食品加工、酿酒、造纸和饲料等领域，对解决环境污染和能源危机具有重大意义［1-2］。纤维素酶广泛存在于多种微生物中，其中里氏木霉（Trichoderma reesei）是目前研究最透彻的产……