红梅 周健 陈蒙恩等

摘要：采用响应面法从传统大曲中筛选的异常威克汉姆酵母J7发酵产苯乙醇条件，在单因素试验的基础上，以酵母菌株J7发酵产物中大曲重要香味物质苯乙醇的色谱峰面积为响应值，原料初始水分含量、装料量、发酵温度为自变量，利用响应面中心组合法进行试验设计，并做响应面分析和优化。结果表明，在发酵温度为35 ℃，初始水分含量为43%，装料量为70 g/250 mL的最优条件下发酵9 d，苯乙醇的色谱峰面积的平均值为1.332×108，接近于模型预测值1.324×108，此时发酵产物中的苯乙醇含量为6.350 mg/100 g，与优质浓香型大曲相比，其含量增长了5倍多。

关键词：响应面法；异常威克汉姆酵母；浓香型大曲；苯乙醇

中图分类号：TS261.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）14-3492-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.041

Optimization of Phenylethanol Fermentation Conditions of Wickerhamomyces anomalus from Daqu by Response Surface Methodology

MING Hong-mei， ZHOU Jian， CHEN Meng-en， GUO Zhi ，YAO Xia， LIU Yu-meng

（College of Bioengineering， Sichuan University of Science &Engineering， Zigong 643000， Sichuan， China）

Abstract：Response surface methodology was applied to optimize the phenylethanol fermentation conditions of Wickerhamomyces anomalus from Daqu. On the basis of single factor test， the optimization about dependent variables （phenylethanol the main flavoring substances chromatographic peak area） and independent variables （fermentation temperature， loading weight and moisture content） was carried out by using central composite design. The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows： fermentation temperature 35 ℃， 43% moisture， loading weight of 70 g/250 mL. Fermentation 9 days under the conditions， the average peak area of phenylethanol for 1.332×108， which were well matched with the predictive value 1.324×108， the content of the fermentation product of phenylethanol as 6.350 mg/100 g， compared with the high-quality Luzhou Daqu， phenylethanol content increased more than 5 times.

Key words：response surface methodology；Wickerhamomyces anomalus；strong-flavor Daqu；phenylethanol

大曲是浓香型白酒酿造的发酵剂和生香剂。大曲的生香功能是普通酶制剂所不能取代的，大曲的复合曲香香气的融入及其在酿造体系内的进一步生化演化，赋予了传统浓香型白酒独特的风格特征[1]。苯乙醇是一种具有玫瑰香气的芳香醇[2]，是大曲中的重要香味成分，亦是白酒香味成分及其前体物质[3，4]。除此以外，苯乙醇在酱油、果酒、面包等发酵食品中也含量丰富，是一种可用于食品的香料添加剂。随着人们对绿色食品及食品安全意识的增强，对添加化学香料香精存有的强烈争议，天然的食品香料添加剂的研发成为新的热点[5]。

响应面法是统计方法与数学方法结合的产物，是用来对关注的、受多个变量影响的问题进行建模分析、最终进行优化的方法。目前在食品及生物等领域[6-8]应用较广。本研究以传统浓香型大曲中分离获得的一株产香异常的威克汉姆酵母为菌种，小麦固体培养基为底物，在单因素试验的基础上，利用响应面法进一步优化其发酵产苯乙醇的条件，以期为白酒生产中香曲的制备及相关领域的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种：异常威克汉姆酵母J7，从泸州老窖“久香”牌中高温浓香型大曲中分离获得。

酵母活化培养基：蛋白胨5 g，磷酸二氢钾1 g，葡萄糖10 g，孟加拉红0.033 g，硫酸镁0.5 g，琼脂18.5 g，去离子水1 000 mL，121 ℃下灭菌20 min。

酵母种子培养基：葡萄糖20 g，胰蛋白胨20 g，酵母浸出膏10 g，去离子水1 000 mL，pH 5.0～5.5，分装于试管中，121 ℃下灭菌20 min。

小麦固体培养基：称取经适度粉碎的小麦适量，调节水分含量为40%左右，置于250 mL三角瓶中，121 ℃下灭菌20 min。

仪器与设备：SW-CJ-2F型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；THC-330型摇床，上海一恒科学仪器有限公司；MJ-250型恒温培养箱，上海和羽电子科技有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，美国Supelco公司；手动SPME进样器，美国Supelco公司；15 mL带硅橡胶垫的样品瓶，美国Supelco公司；Agilent 6890N-5975B型气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司。

1.2 试验方法

1.2.1 固态产香试验 菌株J7经活化后接入种子培养基，在28 ℃下培养48 h后调节种子液浓度至107个/mL。灭菌冷却后的小麦固体培养基中加入液化酶（10 U/g原料）、糖化酶（100 U/g原料）、酸性蛋白酶（20 U/g原料），酶制剂均用去离子水溶解并用0.22 μm滤膜除菌，然后以10%接种量接入菌株J7种子液，于28 ℃下发酵9 d后对其发酵产物进行感官评定、挥发性成分定性和半定量分析。

1.2.2 发酵产物感官评定 评定小组由10名专业人员组成，对各试验组发酵产物进行外观、气味评定。

1.2.3 发酵产物挥发性物质检测[9] 固相微萃取条件：将发酵产物研磨后精确称取4.0 g，于15 mL进样瓶中60 ℃水浴平衡15 min，经顶空吸附30 min、230 ℃气质联用仪解析3 min后进行鉴定。气相色谱条件：毛细管色谱柱为DB-WAX，规格为（60 m×250 μm，0.25 μm）；手动进样，进样口温度250 ℃；程序升温：初始40 ℃稳定1 min后，以3 ℃/min的速率升至180 ℃，再以2.5 ℃/min升至230 ℃，稳定10 min；气化室温度250 ℃；载气He，流速1 mL/min。质谱条件：EI电离源，扫描范围20～500 u，电子能量70 eV，离子源温度250 ℃，接口温度230 ℃。

1.2.4 挥发性物质定性与半定量分析 定性分析：将发酵产物中检出的挥发性物质的质谱图与标准谱库（NIST）进行比对，匹配度>800的结果予以公布。半定量分析：以正丁醇为内标，将样品挥发性物质的浓度与正丁醇质量浓度作比进行计算。

1.2.5 单因素试验 采用单一变量法，依次改变发酵温度（23、28、33、38、43 ℃）、装料量（10、40、70、100、130 g/250 mL）及初始水分含量（26%、34%、42%、50%、58%）对菌株J7发酵产苯乙醇的影响，并对较佳发酵参数进行选取。

1.2.6 响应面优化 在单因素试验的基础上，以大曲重要香味物质苯乙醇的色谱峰面积为评价指标，进行17组5个中心点的Box-Behnken响应面试验设计及分析[10-12]，最终确定最佳发酵参数。所有试验除非特殊说明均设3个重复，其各因素与水平见表1。

1.3 数据处理

运用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 温度对菌株J7发酵产苯乙醇的影响 通过设置不同的温度研究其对菌株J7发酵产苯乙醇的影响，结果见图1。由图1可知，菌株J7在33 ℃下发酵时产苯乙醇含量最高。苯乙醇可由苯丙氨酸转化而来，其含量与蛋白酶活性及产香酵母的生长代谢有关[13]，当温度过低时，不利于蛋白酶的催化作用及酵母菌的生长繁殖；随着温度的升高，蛋白酶水解作用增强，氨基酸生成量增多，酵母菌大量生长繁殖，有利于苯乙醇的积累；当温度超过40 ℃时，酵母菌的生长受到抑制，酶的稳定性也会下降，33 ℃为酶、菌协同作用的较佳温度。因此，选取30、33、36 ℃作为菌株J7发酵产苯乙醇的响应面试验参数，以确定最佳发酵温度。

2.1.2 装料量对菌株J7发酵产苯乙醇的影响 通过设置不同的装料量研究其对菌株J7发酵产苯乙醇的影响，结果见图2。由图2可知，苯乙醇的色谱峰面积在装料量为70 g/250 mL附近时为较大值。装料量过多或过少均会影响苯乙醇的生成量，装料量过少时，虽基质溶氧量较高，但不利于保温，因而影响蛋白酶的催化作用及酵母菌的生长繁殖，当装料料量过大时，基质中溶氧量过低菌体生长代谢受到抑制，同时产生的热量不利于散失，也会导致酵母菌和酶的失活，致使苯乙醇生成量降低。因此，选取装料量50、70、90 g/250 mL作菌株J7发酵产苯乙醇的响应面试验参数，以确定最佳装料量。

2.1.3 水分含量对菌株J7发酵产苯乙醇的影响 通过设置不同的初始水分含量研究其对菌株J7发酵产苯乙醇的影响，结果见图3。由图3可知，苯乙醇的含量随着水分含量的增大呈现一个先增加后降低的趋势。水分含量过低时，不利于蛋白酶的水解作用及产香酵母的生长繁殖，当水分含量过高时可能导致小麦基质的透气性下降，影响菌体的生长代谢，因而苯乙醇的生成量降低。苯乙醇色谱峰面积在水分含量为42%附近时出现较大值，因此选取水分含量34%、42%、50%作菌株J7发酵产苯乙醇的响应面试验参数，以确定最佳水分含量。

2.2 响应面优化发酵苯乙醇条件

2.2.1 响应面试验设计及结果 对菌株J7发酵产苯乙醇条件进行响应面分析，具体试验设计及结果见表2。运用Design-Expert8.0.6软件进行二次回归拟合后，得到以下回归方程：

Y=1.378×108+8.084×105A+2.466×106B+5.185×106C-2.420×106AB-3.072×106AC-4.171×106BC-1.374×107A2-1.251×107B2-1.125×107C2。

回归模型方差分析见表3。由表3可知，模型的P值小于0.01，F值为35.193。由方差分析可知，模型失拟项中P>0.05，说明该模型选择比较合理。B、C、BC、A2、B2、C2的P值小于0.05，表明这些因素对模型显著，该方程对试验拟合情况较好。模型R2为97.8%，表明该模型与实际情况拟合良好，可以用于菌株J7最佳发酵产苯乙醇条件的分析和预测。

2.2.2 各因素之间的交互作用 利用响应面回归分析、回归方程和Design-Expert 8.0.6软件绘制三维响应曲面图，探究两因素间交互作用对产香酵母J7发酵产苯乙醇的影响，结果见图4至图6。由图4至图6可以看出，温度、装料量和初始水分含量对产香酵母J7发酵产香的影响均非常显著，温度、装料量和初始水分含量过高或过低都会使产香酵母J7发酵产苯乙醇的含量降低。当各因素大小从四周逐渐趋向中心点时，曲面图呈凸起趋势，说明相关因素交互作用越强，即菌株J7发酵产苯乙醇能力趋向最大化，说明存在最大响应值。运用Design-Expert 8.0.6软件对结果进行分析，当预测的响应值最大时，3个因素的最佳值为：温度35.01 ℃，初始水分含量43.072%，装料量70.22 g/250 mL，预测香味物质苯乙醇的色谱峰峰面积为1.324×108。考虑到实际情况，采用温度为35 ℃，初始水分含量为43%，装料量为70 g/250 mL进行验证试验，重复3次，结果显示，发酵产物中大曲重要香味物质苯乙醇的色谱峰面积平均值为1.332×108，与预测值1.324×108接近，证明拟合模型能较好的找出产香酵母J7的最佳发酵产苯乙醇条件。

2.3 定量分析结果

以正丁醇为内标物，对产香酵母J7在最优条件下的发酵产物、优质浓香型大曲、小麦原料中的苯乙醇含量进行定量分析，测得苯乙醇在小麦原料、优质浓香型大曲、J7发酵产物中的含量分别为0.058、1.026、6.350 mg/100 g，三者的总离子流色谱见图7至图9。由图7至图9色谱峰可知，酵母J7发酵产物中，苯乙醇含量相较于小麦原料及优质浓香型大曲均有显著的提高，相较于小麦原料其含量增长了108倍多，相较于优质浓香型大曲其含量增长了5倍多。

3 结论

采用响应面法对传统浓香型大曲中分离筛选的异常威克汉姆酵母J7的产香条件进行优化，取得了良好效果：酵母J7在温度为35 ℃，初始水分含量为43%，装料量为70 g/250 mL的条件下进行固体小麦产香试验，发酵9 d后苯乙醇色谱峰面积的平均值为1.332×108，与预测值较为接近。发酵产物中苯乙醇含量为6.350 mg/100 g，相较于优质浓香型大曲其含量增长了5倍多，相较于小麦原料其含量增长了108倍多。小麦培养基经过淀粉酶及蛋白酶处理后接种产香异常威克汉姆酵母J7可用于浓香型白酒生产中香曲制备，也可采用现代分离技术从香曲中分离纯化香味物质苯乙醇，并应用于白酒的勾兑调味或其他发酵食品。天然的苯乙香料添加剂越来越受到广大消费者的欢迎，具有很好的开发前景，后续可对多菌共酵产生香味成分苯乙醇及其对于苯乙醇的生成与积累的影响进行研究。

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