于爽+高剑+郝婧玮+何婷婷

摘要：利用响应面法对白头翁（Pulsatilla chinensis）皂苷的微波提取条件进行了优化。在单因素试验基础上，利用Box-Behnken中心组合设计原理及响应面法分析并建立二次回归模型。以乙醇体积分数、微波功率、微波时间为考察因素，以白头翁皂苷提取率为响应值，研究了各因素对白头翁皂苷提取率的影响。确定最佳微波提取条件为乙醇体积分数50%、微波功率300 W、微波时间4 min，在此条件下，白头翁皂苷提取率达到5.33%。

关键词：白头翁（Pulsatilla chinensis）；皂苷；微波辅助提取；响应面法

中图分类号：S567.23+9；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5348-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.045

Abstract：The response surface methodology was used to optimize the microwave-assisted extraction conditions of pulchinenoside. Based on the single factor experiment，a quadratic regression model was established using the principle of Box-Behnken central composite design and the response surface method. Taking the ethanol volume fraction，microwave power and irradiation time as investigation factors，and extraction rate of pulchinenoside as response value，the effects of various factors on the extraction rate of pulchinenoside were studied. The optimal extraction conditions determined were ethanol volume fraction of 50%，microwave power of 300 W，and extraction time of 4 min. Under these conditions，the extraction rate of pulchinenoside was 5.33%.

Key words：Pulsatilla chinensis；pulchinenoside；microwave-assisted extraction；response surface methodology

中药白头翁为毛茛科植物白头翁（Pulsatilla chinensis）的干燥根，始载于《神农本草经》，其性味苦寒，具有清热解毒、凉血止痢、燥湿杀虫之功效[1，2]。它的化学成分有白头翁皂苷、胡萝卜甙、白头翁素等，主要有效成分为白头翁三萜皂苷[3，4]。现代药理研究表明，它具有增强免疫力、抗炎、抗肿瘤、抗病原微生物等作用[5，6]，尤其在抗肿瘤及抗癌的新药开发方面有很大的应用潜力[7，8]。近年研究还发现其所含的某些活性成分对治疗老年性痴呆（阿尔茨海默病）效果显著[9，10]。

微波辅助提取技术（MAE）利用每秒几亿次周期变化的微波透入物料内，使物料内的各部分在同一瞬间获得能量促使细胞破裂，使细胞液溢出并扩散到溶剂中，从而达到提取有效成分的目的[11]，具有省时、高效，操作简便、提取成本低等优点[12]。本研究以白头翁为原料，白头翁皂苷B4含量为指标，采用微波辅助溶剂提取白头翁皂苷，考察了乙醇体积分数、微波功率、微波时间等因素对白头翁皂苷提取率的影响，并通过响应面法对主要因素进行了优化，旨在为白头翁皂苷的综合利用提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白头翁干燥根，购自牡丹江市老百姓大药房；白头翁皂苷B4标准品，纯度≥98%，贵州迪大生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯），J&K CHEMICAL LTD公司；甲醇、乙醇（分析纯）；水为实验室自制超纯水。

SB-5200DTN型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；XH-MC-1型实验室微波合成仪（祥鹄科技发展公司）；Waters 2695型高效液相色谱仪（Waters公司）；Waters 2998型紫外检测器（Waters公司）；色谱柱（4.6 mm×150 mm）；MF 22R型台式微量冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）；BSA2245S-CW型电子分析天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；FZ102微型植物粉碎机（苏州江东精密仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的制作 精密称取白头翁皂苷B4标准品3.00 mg，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容配得浓度为0.600 mg/mL的母液，梯度稀释为0.600、0.300、0.200、0.100、0.050、0.025 mg/mL的标准品溶液，分别标记为1、2、3、4、5、6，经4 000 r/min离心10 min后，依次取6组标准品溶液，在检测波长为201 nm，流动相为乙腈∶水∶磷酸（27∶73∶0.1），等度洗脱，洗脱流速为1.0 mL/min；25 ℃柱温的高效液相色谱条件下进样10 μL。绘制标准曲线，得出回归方程。

1.2.2 单因素试验 将白头翁干燥根于微型植物粉碎机中粉碎，過50目筛，准确称取5.0 g，若干份，分别加入一定体积分数的乙醇溶液，配制成不同料液比（g∶mL，下同）的样品溶液，在一定的微波功率下提取一定的时间，趁热抽滤，4 000 r/min离心10 min，取上清液入高效液相色谱仪，将得到的峰面积代入回归方程，依下式计算白头翁皂苷B4提取率，重复操作3次取平均值，考察不同因素对白头翁皂苷提取率的影响。

式中，Y为提取率，%；C为目的成分的浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；M为原料重量，g。

1.2.3 响应面试验设计 综合单因素试验的分析结果，选择乙醇体积分数、微波功率及微波时间为考察因素，以白头翁皂苷提取率为响应值，利用Box-Behnken设计试验，见表1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线方程

以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到回归方程为Y=2 586.4X-26.734，R2=0.999 6，白头翁皂苷在0.025～0.600 mg/mL。

2.2 单因素试验结果

单因素试验结果见图1。初步选定过50目的白头翁粉末，乙醇体积分数60%、料液比1∶8、微波功率300 W、微波时间4 min为最佳提取条件，采用响应面法对微波辅助提取白头翁皂苷的条件进行优化。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 回归模型的建立及方差分析 通过软件Design expert 7.0对试验设计及结果（表2）中的试验数据进行分析，可得到白头翁皂苷提取率与各个影响因素之间的关系模型为：

Y=5.150-0.021A-0.100B+0.081C-0.031AB-0.410AC+0.490BC-0.500A2-0.620B2-0.160C2

在试验设计范围内，对一次项系数进行分析可知，各因素影响顺序为：乙醇体积分数<微波时间<微波功率。对模型的各项因素数据进行方差分析，具体结果见表3。由表3可知，整个响应面的回归方程模型的P值小于0.01，呈极显著水平，而失拟项F=2.14，P=0.238 1，二者均大于0.05可知，失拟项不显著，且试验误差小，说明这是一项拟合度较高的回归模型；此外，该模型R2=0.967 5，模型校对系数R2adj=0.925 8，表明模型可以解释92.58%的响应值变化范围，因此，该模型可以对微波辅助溶剂法提取白头翁皂苷效果进行分析和预测。

2.3.2 响应面图分析 响应面图形是反映响应值与各个试验因素之间变化的三维图形，可从中分析出参数与最佳参数间的相互作用关系[13，14]。基于二次回归模型进行响应面绘图，分别给出了各因素间交互影响显著的响应面图（图2）。3个响应曲面均为开口向下的凸形曲面，乙醇体积分数、微波功率、微波时间3个因素与白头翁皂苷的提取率呈抛物线关系，各因素对白头翁皂苷提取效果的影响较为显著，且在考察范围内存在响应值的极高值。乙醇体积分数在45%～55%，微波功率在250～350 W，微波时间在3～5 min的范围内有较大的响应值。运用 Design expert 7.0软件对试验结果进行优化，得出皂苷提取率最大时乙醇体积分数48.7%、微波功率295.8 W、微波时间4.25 min，考虑到操作的简便及实际情况，选择最优条件为微波时间4 min、微波功率300 W、乙醇体积分数50%。采用上述优化条件进行重复试验，得出实际提取率为5.33%。因此，在实际应用提取时，可利用本研究响应面法优化后的提取条件，该参数可靠、准确、实用。

3 结论

微波辅助溶剂提取法进行了单因素试验研究，考察了料液比、乙醇体积分数、微波功率、微波时间等因素对白头翁皂苷提取率的影响，发现微波功率、微波时间、乙醇体积分数的影响较为显著，因此，利用Design expert 7.0软件的响应面设计对主要影响因素进行了优化，得出各因素的影响顺序：微波功率>微波时间>乙醇体积分数，确定最佳微波提取条件为乙醇体积分数50%、微波功率300 W、微波时间4 min，此条件下白头翁皂苷提取率达到5.33%。

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