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响应面法优化超声波辅助提取白头翁总皂苷

2017-03-28于爽郝婧玮孙晓薇高剑李帅杨传伟

湖北农业科学 2017年4期
关键词:响应面法

于爽 郝婧玮 孙晓薇 高剑 李帅 杨传伟

摘要:采用响应面法优化了超声波法辅助提取白头翁总皂苷(pulsatilla saponin)的条件。以白头翁皂苷B4提取率为评价指标,在单因素试验的基础上,利用Box-Behnken响应面分析法,确定最佳提取条件。结果表明,超声波辅助提取白头翁总皂苷的最佳工艺参数为超声功率240 W,乙醇体积分数60%,超声时间30 min。在此条件下白头翁皂苷提取得率为5.35%。响应面法优化得到的提取工艺稳定合理,准确可靠,是提取白头翁皂苷的可行方法。

关键词:白头翁皂苷(pulsatilla saponin);超声波辅助提取;响应面法

中图分类号:TS229 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2017)04-0707-05

中药白头翁为毛茛科植物白头翁[Pulsatilla Chinensis(Bge.) Regel]的干燥根,始载于《神农本草经》,其性味苦寒,具有清热解毒、凉血止痢、燥湿杀虫之功效[1,2]。其化学成分有白头翁皂苷(pulsatilla saponin),胡萝卜甙,白头翁素等,主要有效成分为白头翁三萜皂苷[3,4]。现代药理研究表明,它具有增强免疫力,抗炎、抗肿瘤、抗病原微生物等作用[5,6],尤其在抗肿瘤及抗癌的新药开发方面有很大的应用潜力[7,8]。近年研究还发现其所含的某些活性成分对治疗老年性痴呆(阿尔茨海默病)效果显著[9,10]。

近年来,超声波技术已经被普遍应用于提取植物中生物活性物质,其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分等特点。超声波在液体介质中传播时,可以在样品和溶剂间产生特殊的空化作用,超声波空化时产生的极大压力可以提高细胞壁的通透性,使细胞内的成分释放,直接与溶剂接触并溶解,提高了成分从固相转移到液相的传质速率[11-13]。本研究以白头翁皂苷B4的提取得率为指标,研究了影响白头翁总皂苷超声辅助提取效果的各因素,并通过响应面分析法,确定了最佳提取工艺条件,为进一步开发利用白头翁的药用价值提供了可靠依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白头翁饮片,产地东北,购自蔺氏盛泰药业有限公司;白头翁皂苷B4标准物质(贵州迪大生物科技有限公司);其他试剂均为分析纯。Waters 2695高效液相色谱仪(Waters公司);Microfuge 22R台式微量冷冻离心机(美国贝克曼库尔特公司);JAC-600超声波中药处理机(山东济宁超声电器有限公司);色谱柱(4.6 mm×150 mm);BSA2245S-CW电子分析天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司);FZ102微型植物粉碎机(江东精密仪器公司);自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣公司)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Shimadzu VP-ODS (4.6 mm×150 mm,4.6 μm),流动相为乙腈-水-磷酸(27∶73∶0.1,v/v),等度洗脱,洗脱流速为1.0 mL/min,检测波长为201 nm,柱温为25 ℃,进样体积10 μL,收集时间为17.201 min,定量方法为外标工作曲线法。

1.2.2 标准曲线方程 精密称取白头翁皂苷B4标准品3.00 mg置于5 mL容量瓶中,加入无水甲醇溶液定容至刻度,用0.45 μm微孔滤膜过滤,将白头翁皂苷B4标准品母液依次梯度稀释为0.300、0.200、0.100、0.050、0.025 mg/mL,按上述色谱条件测定峰面积,以质量浓度(mg/mL)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。以峰面积Y和皂苷含量X进行线性回归,得到回归方程为Y=2 586.4X-26.734,r=0.999 6,白头翁皂苷含量在0.025~0.600 mg/mL。

1.2.3 样品中白头翁皂苷的测定 将白头翁根粉碎,过50目筛,准确称取5.00 g按一定的料液比,分别加入一定浓度的乙醇溶液,设定超声功率和超声时间进行提取,提取完毕后,滤液4 000 r/min离心10 min,取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤,精密吸取各供试品溶液10 μL,按上述给定的条件测定峰面积,以回归方程计算含量。

Y=CV/M×100%

式中,Y为提取得率;C为白头翁皂苷B4浓度(mg/mL);V为提取液体积(mL);M为原料质量(mg)。

1.2.4 超声波辅助提取白头翁皂苷的单因素试验 分别选取不同的粒径大小、乙醇体积分数、料液比(g/mL,下同)、超声时间、超声功率和超声次数进行单因素试验,考察各单因素对白头翁皂苷提取得率的影响。

1.2.5 响应面分析法优化白头翁皂苷的提取条件 在单因素试验的基础上,进一步考察超声功率、乙醇体积分数、提取时间对白头翁皂苷提取效果的影响,利用Box-Behnken来设计试验,根据中心组合试验设计原理,以白头翁皂苷提取得率为响应值,采用3因素3水平的响应面分析法,对超声提取条件进行优化,因素水平见表1。

2 结果与分析

2.1 超声辅助法提取白头翁皂苷的单因素试验

2.1.1 粒径大小对白头翁皂苷B4提取得率的影响 由图1可见,白头翁粉末颗粒越小,白头翁皂苷提取得率越高。当达到50目的粒径时,白头翁皂苷提取得率可达到5.19%,虽然60目的粒径,白头翁皂苷提取得率会略有增加,但样品过于细小会将其他的糖等物质溶出,不利于后续试验的进行,故选择50 目的白头翁粉末。

2.1.2 料液比对白头翁皂苷B4提取得率的影响 由图2可见,当料液比为1∶8时,白头翁皂苷的提取得率可以达到最大,溶剂的量再继续增加,白头翁皂苷提取得率反而下降,其原因可能是当溶剂用量增大到一定程度时,超声波能量过多的作用于溶剂,影响了白头翁皂苷提取得率,故料液比确定为1∶8。

2.1.3 乙醇体积分数对白头翁皂苷B4提取得率的影响 由图3可见,增大乙醇体积分数,白头翁皂苷提取得率呈上升趋势,乙醇体积分数为60%时,皂苷提取得率达到最大值5.33%,当体积分数继续增加,皂苷提取得率反而呈下降趋势。可能原因是过高的乙醇体积分数使得细胞壁处于收缩状态,阻碍了皂苷的溶出,故确定60%为乙醇的最佳体積分数。

2.1.4 超声功率对白头翁皂苷B4提取得率的影响 由图4可见,随着超声功率的增加,白头翁皂苷提取得率呈上升趋势,超声功率为60%(240 W)时,皂苷提取得率达到最大值5.33%,当超声功率超过60%(240 W)时,皂苷提取得率开始下降。因此确定超声提取功率为60%(240 W)。

2.1.5 超声时间对白头翁皂苷B4提取得率的影响 由图5可见,随着超声时间的延长,白头翁皂苷的提取得率先升高后降低,在30 min时得率达到最高为5.24%;30 min后皂苷的得率降低,原因可能是白头翁皂苷分子的化学键等被持续的超声波破坏,甚至是断裂,得到了其他产物,所以确定超声提取时间为30 min。

2.1.6 超声次数对白头翁皂苷B4提取得率的影响 由图6可见,随着超声次数的增加,白头翁皂苷提取得率呈上升趋势,且在第2次提取时增加明显,进一步增加超声次数,白头翁皂苷提取得率有所提高但不显著,考虑降低能耗及成本、节约溶剂,确定提取2次为宜。

综上所述,根据单因素条件试验,初步选定过 50目的白头翁粉末料液比1∶8,乙醇体积分数60%,超声功率240 W,超声时间30 min,超声次数2次为最佳提取条件,采用响应面法对超声辅助提取白头翁皂苷工艺条件进行优化。

2.2 响应面优化超声辅助溶剂提取白头翁皂苷

2.2.1 回归模型的建立及方差分析分析 超声功率(A)、乙醇体积分数(B)、超声时间(C)3个因素对白头翁皂苷得率(Y)的影响,采用响应面进行试验设计。试验设计及结果如表2。将所得试验数据通过软件Design expert 7.0进行多元回归拟合,白头翁皂苷提取得率与超声提取各因素变量的二次回归方程模型为:

Y=5.220+0.140A-0.096B+0.150C-0.200AB-0.089BC-0.470A2-0.560B2-0.630C2

根据回归方程模型及试验数据对其各项进行方差分析(表3)。由表3可知,二次回归方程模型可达到极显著(P<0.01)水平,其中,失拟项F=5.26(P>0.05)且误差小,表明该方程模型对试验数据处理及分析的结果有效可靠,决定系数为0.918 5,说明该模型的解释程度较高,可以反映出91.85%的响应值变化,拟合精度较好,可以预测白头翁皂苷的不同提取条件。根据各因素的F值比较可知,影响程度最大的因素是C,其次为B,A的影响程度相对较小。一次项(A、C)交互项(AB)对结果有着显著影响(P<0.05),二次项(A2、B2、C2)对结果影响极显著(P<0.01)。

2.2.2 响应面图分析 响应面图形是反映响应值与各个试验因素之间变化的三维图形,可从中分析出参数与最佳参数间的相互作用关系,测试因素间的交互作用关系由等高线的形状反映,若两因素相互作用显著则呈现椭圆形。当其形状越向圆形趋近时,交互作用越弱。如果为标准圆形,可认为这两因素之间的相互作用可忽略不计。由图7-图9可以看出,超声功率(A)、乙醇体积分数(B)、超声时间(C)3个因素与白头翁皂苷的提取得率(Y)呈抛物线关系,在自变量A、B、C的取值范围内,Y有着相应的极高值与其对应。

3 提取工艺条件的确定

为进一步确定最佳工艺点,在模型浓度范围内选择出发点,按照模型使用快速上升法进行优化,可得最佳理论工艺条件为超声时间29.35 min,超声功率59.08%,乙醇体积分数60.95%。考虑到实际应用,将提取工艺参数修正为超声时间30 min,乙醇体积分数为60%,超声功率为60%(240 W),白头翁皂苷提取得率达到5.45%,与理论值接近。因此,基于响应面法所得的优化提取工艺参数准确可靠,具有实用价值。

参考文献:

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010)[S].北京:中国医药科技出版社,2010.

[2] 刘 琳,金凤燮.白头翁皂苷的分离提纯[J].大连轻工业学院学报,2004,23(1):18-21.

[3] 钟长斌,李 祥.白头翁的化学成分及药理作用研究述要[J].中医药学刊,2003,21(8):1338.

[4] BANG S C,KIM Y,LEE J H,et al. Triterpenoid saponins from the roots of Pulsatilla koreana[J].J Nat Prod,2005,68(2): 268-272.

[5] 舒 瑩,韩广轩,刘文庸,等.中药白头翁的药材、化学成分和药理作用的研究[J].药学实践杂志,2000,18(6):387.

[6] 蔡 鹰,唐永明,梁秉文.白头翁体外抗肿瘤实验研究[J].中草药,1999,30(6):441-443.

[7] XU Q M, SHU Z, HE W J,et al.Anti-tumor activity of Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel saponins in human liver tumor 7402 cells in vitro and in vivo[J].Phytomedicine,2012,19(3):293-300.

[8] 庄贤韩,耿宝琴,雍定国.白头翁抗肿瘤作用实验研究[J].实用肿瘤杂志,1999,12(5):94-97.

[9] HAN C K,PARK Y H,JIN D Q,et al.SK-PC-B70M from Pulsatilla koreana improves scopolamine-induced impairments of memory consolidation and spatial working memory[J].Brain Research,2007,1184(12):254-259.

[10] XUE J F,LIU Z J,HU J F,et al.Ginsenoside Rb1 promotes neurotransmitter release by modulating phosphory-lation of synapsins through a cAMP-dependentprotein kinase pathway[J].Brain Res,2006,11(6):91-98.

[11] 岳春华,贲永光,孔繁晟,等.超声提取芦笋总皂苷的实验研究[J].时珍国医国药,2011,22(9):2105-2107.

[12] 李 健,陈姝娟,张若男,等.超声辅助溶剂法提取肉桂总皂苷工艺的研究[J].食品科学,2008,29(4):177-180.

[13] 丁 霞,朱 浩,张战运.超声醇提龙葵总皂苷工艺及定量测定研究[J].中成药,2011,33(8):1442-1444.

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