陈婵，黄靖，丁玲（福建农业职业技术学院，福建福州350119）

超声波辅助提取大球盖菇总黄酮工艺优化

陈婵，黄靖，丁玲（福建农业职业技术学院，福建福州350119）

摘要：主要研究了超声波辅助提取大球盖菇中总黄酮的提取工艺，研究了乙醇浓度、超声功率、时间、料液比对大球盖菇总黄酮提取率的影响。通过单因素试验和正交试验确定了大球盖菇黄酮类化合物的优化提取工艺条件。超声波优化提取工艺条件为：乙醇浓度30%，料液比1∶15（g/mL），超声功率120 W，时间1 h，总黄酮的提取率为1.138%。

关键词：大球盖菇；总黄酮；超声波辅助提取

大球盖菇（Stropharia rugoso-annulata Farlow）别名皱环球盖菇、皱球盖菇、酒红大球盖菇、裴氏球盖菇、裴氏假黑伞，是欧美各国人工栽培的著名食用菌之一，也是联合国粮农组织（FAO）向发展中国家推荐栽培的食用菌之一。大球盖菇栽培原料来源丰富，技术简单，产量高，成本低，经济效益可观，在广大农村极易推广[1]。大球盖菇菇味清香、肉质脆嫩、适口性好、产量高，其子实体中富含蛋白质、维生素、矿物质和多糖等营养成分[2]。

黄酮类化合物是存在于自然界的一大类的化合物，是一种对人体非常有用的活性物质，是许多药品和保健品的主要成分，它具有杀虫、抗病毒、保护心脑血管系统和祛痰的生理活性。黄酮化合物提取一般采用水、酸、或碱和有机溶剂对植物进行浸提，但细胞壁中的纤维组织会像一个天然屏障阻碍有效物质的提取的，且往往耗时费药。陈君琛[3]等研究了大球盖菇黄酮类化合物提取及抑菌性研究，结果表明：乙醇体积分数95%，料液比为1∶90（g/mL），温度60℃，时间120 min，提取率为0.794%。超声波具有很大的能量，它的强烈搅拌、振动、空化作用可以破坏细胞结构，加速有效物质的溶出，不仅可以提高提取效率，而且可以大大缩短时间，节省能源。本文采用超声波辅助强化提取大球盖菇总黄酮的含量，避免提取时间长，提取不完全的缺点，同时也提高了提取的效率，研究超声波辅助提取工艺的最佳路线。该研究成果对为大球盖菇的总黄酮的提取路线提供参考，同时为大球盖菇的综合开发利用提供参考。

1　材料、仪器与方法

1.1材料与试剂

大球盖菇：产自福建省将乐县。

芦丁标准品（Aladdin chemistry co.Ltd芸香叶苷，分析标准品，≧98%）；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇等所用试剂均为分析纯。

1.2主要仪器

722s可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；101-2型鼓风干燥箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；KQ-300VDE超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；BS224S电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1大球盖菇黄酮类化合物提取工艺流程

大球盖菇→50℃烘干→粉碎→过60目筛→一定量的大球盖菇加一定溶剂超声波辅助提取→离心→检测。

1.3.2标准溶液的配制与标准曲线的绘制[4]

精密称取芦丁标准品10mg，以60%的乙醇定容至5 mL，再加蒸馏水稀释至10 mL。得到浓度为1.0 mg/mL芦丁标准液。准确吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL芦丁溶液于10 mL具塞刻度试管中，先加5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀放置6 min后，加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀放置6 min，最后加1 mol/mL NaOH溶液4.0 mL，用60%乙醇定容至刻度，摇匀后放置15 min，在510 nm下测定吸光度，以芦丁含量为0的处理为空白对照，得标准曲线。

1.3.3样品中总黄酮提取的测定及计算

称取1 g的干燥样品，用一定溶度的乙醇溶液以一定的料液比在一定功率下超声波辅助提取一定时间，离心过滤，定容。取上清液0.3 mL，放入具塞刻度试管中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀放置6 min后，加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀放置6 min后，加1 mol/mL NaOH溶液4.0 mL，用60%乙醇定容至刻度，摇匀后放置15 min，以芦丁含量为0的处理为空白对照，在510 nm下测定吸光度，并算出其总黄酮提取率。

总黄酮的提取率/%=提取总黄酮质量/原料的质量×100

1.3.4单因素试验及正交试验

乙醇溶度采用10%、30%、50%、70%、90%5个水平；料液比（干粉质量∶溶剂，g/mL）采用1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 4个水平；浸提时间采用0.5、1、1.5、2、2.5 h 5个水平；浸提功率120、180、240、300 W 4个水平分别进行单因素试验。根据单因素试验结果确定正交试验因素，选取L9（34）正交表做正交试验，得出超声波辅助强化提取大球盖菇总黄酮的最佳工艺参数。

1.3.5验证试验及精密度试验[5-6]

准确称取1 g大球盖菇粉末5份，以正交试验得出的最佳提取工艺进行5次平行试验，分别按照1.3.3中的方法进行总黄酮含量的测定。

以正交试验得出的最佳提取工艺进行5次平行试验，然后分别准确量取2.00 mL待测液于5个10 mL比色管中，分别按照1.3.3的方法进行总黄酮含量的测定。

1.3.6加标回收率[7]

准确移取已知总黄酮质量浓度的样品溶液0.50 mL，平行5份，分别置于25 mL比色管中，再分别准确加入 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的芦丁标准溶液（0.2 mg/mL）。按1.3.2方法得总黄酮质量浓度。

加标回收率/%=（加标试样测定值-试样测定值）÷加标量×100

1.3.7数据分析

应用DPS数据处理系统进行数据分析。

2　结果与分析

2.1总黄酮的标准曲线

精密称取芦丁，配制得到浓度为1.0 mg/mL芦丁标准液。根据方法1.3.2进行数据回归，得标准曲线（芦丁浓度Y和吸光值A的关系）。其回归方程：Y（mg/mL）= 1.114 3X+0.004 8，R2=0.999 8。

2.2乙醇浓度对大球盖菇总黄酮提取率的影响

准确称取大球盖菇干样1 g，分别选用10%、30%、50%、70%、90%5个乙醇浓度，在超声功率为300 W，料液比为1∶10（g/mL）的条件下提取1 h，考察乙醇浓度对大球盖菇总黄酮提取率的影响见图1。

图1　乙醇浓度对大球盖菇总黄酮提取率的影响Fig.1　Effects of alcohol concentrati on extraction rate of flavonoids

图1表明：大球盖菇总黄酮的提取率随着乙醇溶度的增加先增加后减少，当乙醇浓度为30%时大球盖菇总黄酮的提取率最大，提取率达到0.667%。原因可能在于：高浓度的乙醇溶液使得一些醇溶性杂质、色素、强亲脂性成分溶出量增加，杂质与黄酮类化合物竞争与乙醇-水分子溶液体系结合，导致提取率下降。

2.3提取时间对大球盖菇总黄酮提取率的影响

准确称取大球盖菇干样各1g，在乙醇浓度为30%，料液比为1∶10（g/mL），功率300 W分别提取0.5、1、1.5、2、2.5 h，考察提取时间对大球盖菇总黄酮提取率的影响。此外，本文采用连续超声波辅助提取，不调整温度的情况下，考察了在超声波辅助提取大球盖菇总黄酮过程中，浸提温度的变化情况，结果见表1。

结果表明：随着超声波辅助强化提取时间的延长，浸提温度也随之增加，当提取时间为1 h时，温度从室温上升至45℃，提取2.5 h后温度上升至68℃，而大球盖菇总黄酮提取率随着提取时间的延长先增加后下降，提取时间为1h时，提取率最高达到0.775%，原因可能在于在用超声波辅助强化提取大球盖菇总黄酮过程中，提取液的温度不断上升，提取时间过短时，总黄酮物质未充分溶出，提取时间过长，一方面由于浸提温度的上升，长时间的超声波反而造成总黄酮的降解，另一方面，随着浸提时间的延长，其他的物质也随之浸提出来，造成总黄酮提取率的下降。

表1　超声波辅助强化提取大球盖菇总黄酮过程中温度的变化情况Table 1　The temperature change on extraction process of total flavonoids from ultrasound extraction

图2　不同时间对大球盖菇总黄酮提取率的影响Fig.2　Effects of supersonic time on extraction rate of flavonoids

2.4料液比对大球盖菇总黄酮提取率的影响

准确的称取1 g的大球盖菇干样，分别选用料液比为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）在超声功率为300 W，乙醇浓度为30%条件下提取1 h，考察料液比对大球盖菇总黄酮提取率的影响见图3。

图3　料液比对大球盖菇总黄酮提取率的影响Fig.3　Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids

图3表明：大球盖菇总黄酮提取率随着料液比的增加先增后减，料液比为1∶10（g/mL）时，总黄酮的提取率最高，随之提取率下降。

2.5超声功率对总黄酮提取率的影响

准确称取1 g大球盖菇干样，分别选用超声功率为120、180、240、300 W时，在料液比为1∶10（g/mL），乙醇浓度为30%提取1 h，考察超声功率对大球盖菇总黄酮提取率的影响。

图4　超声功率对大球盖菇总黄酮提取率的影响Fig.4　Effects of supersonic power on extracti on rate of flavonoids

图4表明：在超声功率为120 W时，有利于黄酮类化合物的渗透和溶解，而超声功率越大提取率降低，可能原因在于：超声功率大可能破坏黄酮类物质，或超声功率较大时导致其它物质析出，杂质溶出量增加。且实际提取过程中考虑到超声波仪器使用寿命和节省电能，低功率可以更好的延长超声波使用寿命。

2.6正交试验结果分析

根据单因素试验的结果，确定以乙醇浓度、超声功率、料液比3种因素进行L9（34）进行正交试验，以干燥后的大球盖菇为试样，提取时间为1 h，以总黄酮提取率为考察对象，从而得到大球盖菇最佳提取条件。试验设计及结果分析如表2所示。

表2　正交试验结果Table 2　The results of orthogonal experiment

为判断上述3种受控制的因素对试验结果的影响，将正交试验数据进行方差分析，结果见表3所示。

表3　正交设计方差分析表Table 3　The table of variance analysis of orthogonal experiment

结果表明：乙醇浓度、超声波功率显著水平均小于0.05都有明显显著性，料液比显著水平（P>0.05）无明显显著性。有关D水平的影响因素也在显著的水平，在超声波辅助强化提取的过程中，提取液的温度也随之上升，因此，D水平的影响因素极有可能为超声过程的温度影响或为超声波的提取时间，可以进一步研究讨论。超声波强化提取大球盖菇总黄酮的最佳提取工艺条件为A2B1C3D1，即乙醇浓度为30%，超声功率为120 W，料液比1∶15（g/mL）的条件下提取1 h。

2.7验证试验及精密度

按照选定的条件A2B1C3D1进行5次平行试验，取平均值，验证了正交试验的结果。得到此条件下的提取率为1.138%，RSD值为0.82%，试验结果稳定，重现性好。表明超声波辅助提取大球盖菇总黄酮工艺可靠，相对标准偏差小、所得数据精确，工艺稳定可行。

2.8加标回收率

根据1.3.6的方法，测定加标回收率，结果（见表4）计算平均回收率为96.0%，RSD=0.73%（n=5），说明方法的准确度好、结果可靠，用此工艺提取大球盖菇总黄酮是可取的。

3　结论

与传统的浸提法相比，超声波辅助提取大球盖菇总黄酮可有效的缩短提取时间，提取功率，是一种行之有效的提取手段。通过单因素和正交试验，得到了超声波辅助提取大球盖菇总黄酮的最佳工艺条件：在乙醇浓度为30%，超声功率为120 W，料液比1∶15（g/mL），时间1 h，提取率为1.138%。表明大球盖菇中含丰富的总黄酮。

对正交试验选定的条件进行验证，表明本文所述方法提取的总黄酮结果稳定，试验重现性好，结果可靠。精密度试验及加标回收试验法测得的结果表明，用紫外分光光度法测定大球盖菇中总黄酮含量的准确度高。

表4　回收率试验Table 4　The experiment of recovery rates

参考文献：

[1]萨仁图雅,图力古尔．大球盖菇研究进展[J]．食用菌学报,2005,12 (4):57-64

[2]张时,李萍,汪尚法．大球盖菇的采后加工[J]．山东蔬菜,2010(1): 43-44

[3] 陈君琛,李怡彬,吴俐,等．大球盖菇黄酮类化合物提取及抑菌性研究[J]．北京工商大学学报(自然科学版),2010,28(6):9-13

[4]张志良,瞿伟菁,李小方．植物生理学试验指导[M]．北京:高等教育出版社,2009:51-54

[5]刘毅君,曾广烨,李爱贞．超声波辅助法提取紫苏叶总黄酮的研究[J]．集美大学学报(自然科学版),2014,19(1):20-24

[6]翟硕莉．超声波法辅助提取香蕉皮中黄酮的工艺研究[J]．食品研究与开发,2014,35(4):33-35

[7] 王宁,李远志,徐莉珍,等．超声波法提取柿子叶总黄酮工艺的研究[J]．现代食品科技,2008,24(7):687-690

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.030

收稿日期：2015-02-03

作者简介：陈婵（1980—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：农产品加工及贮藏。

Study on Ultrasonic Wave Assisted Extraction of Flavonoids from Stropharia

CHEN Chan，HUANG Jing，DING Ling
（Fujian Vocational College of Agriculture，Fuzhou 350119，Fujian，China）

Abstract：The research aimed to study the extraction of total flavonoids from Stropharia with ultrasonic wave treatment．Based on the effect of different factors such as ethanol concentration，ultrasonic wave treatment，ultrasonic time and ratio of material to liquid，On the basis of single-factor experiments，the optimum extraction technology was determined through orthogonal experiments.30%ethanol as extracting agent，ratio of material to liquid of 1∶15 g/mL，processing 120 W with ultrasonic wave and extraction for 1 h．The optimized method is effici-ent，and the extraction yield of total flavonoids reached up to 1.138%。

Key words：Stropharia；flavonoids；ultrasound wave assisted extraction