郭彩珍　褚盼盼　乔元彪

摘 要：采用聚酰胺-大孔树脂联用法对菠菜叶中总黄酮的纯化条件进行研究。以总黄酮的纯度和得率为考察指标，确定纯化菠菜叶总黄酮的最佳树脂为AB-8，其最佳纯化条件为：上样量与聚酰胺量之比为1∶2；上样量与树脂量之比为1∶8；乙醇洗脱的浓度为60%；洗脱流速为2 mL·min-1；洗脱剂的用量为2BV。总黄酮得率最高可达71.42%，纯度可达26.63%。

关键词：菠菜叶；总黄酮；纯化；聚酰胺-大孔树脂联用

中图分类号：S636.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.017

Study on Enriching Total Flavonoids from Spinach Leaves with Polyamide and Macroporous Resin

GUO Cai-zhen，CHU Pan-pan， QIAO Yuan-biao

（Department of Biology， Lyuliang University， Lyuliang， Shanxi 033000， China）

Abstract： Purigying total flavonoids from spinach leaveswith polyamide and macroporous resin was studying in this paper.Purity and yield of total flavonoids as investigates index.The best purified resin of total flavonoids in spinach leaves was AB-8，The optimum experimental conditions were：the best ratio of absorbing solution and polyamide was 1：2；the best ratio of absorbing solution and resin was 1：8；ethanol concentration was 60%；the eluting velocity was 2 mL·min-1；the dosage of the eluting solution was 2BV.The yield of total flavonoids reached to 71.42% and the purity was 26.23%.

Key words： spinach leaves；total flavonoids；purification；combination polyamide and macroporous resin

黄酮类化合物是植物次生代谢产生的一种天然产物，近年来研究报道了黄酮类化合物具有抗菌、降血糖血脂、抗肿瘤、抗氧化性、防治心脑血管疾病等丰富的药理活性[1-3]。蔬菜中黄酮类化合物的含量在0.21～6.44 mg·g-1，而且主要存在于叶中。叶菜中的黄酮类化合物含量远大于茎菜、果菜和根菜[4-7]。菠菜的叶片厚实而且叶肉多，所以含有较多的黄酮类化合物，具有较高的研究价值。目前对菠菜叶片的研究主要集中在色素及提取方面，很少涉及菠菜叶中黄酮类化合物的纯化。本试验首次用聚酰胺-大孔树脂联用对菠菜叶中总黄酮的纯化进行了初步研究，以期为其进一步的开发应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

菠菜叶片：将新鲜的菠菜叶片洗净，置于60 ℃的恒温干燥箱中干燥，粉碎机粉碎备用。

1.2 试剂与仪器

试剂：石油醚、纤维素酶、无水乙醇、芦丁标准品、硝酸铝、亚硝酸钠、硝酸钠、氢氧化钠盐酸（HCl） 以上试剂均为分析纯；D4020、AB-8、S-8、X-5 大孔吸附树脂；聚酰胺。

仪器：电子天平：上海电子仪器；层析柱：上海玻璃仪器厂；高速万能粉碎机：天津市泰斯仪器有限公司；HH-8 数显恒温水浴锅：江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；DGH-9053A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 总黄酮提取物的制备及含量测定 称菠菜叶片粉末适量，用石油醚脱脂后加10倍原料质量的蒸馏水混匀，按酶用量为6.5 mg·g-1，在46 ℃和pH值4.7的条件下进行纤维素酶预处理1.5 h，然后再加入20倍原料的70%乙醇溶液在70 ℃下恒温浸提2次，每次1 h，过滤，合并滤液，浓缩干燥，备用。总黄酮的含量采用NaNO2-Al（NO3）3比色法测定 [8]，以芦丁作标准品，在510 nm的波长下测其吸光值，再绘制标准曲线，并计算回归方程：Y=0.123 6X+0.004 4，式中X为总黄酮的浓度（mg·mL-1），Y为吸光度值。

1.3.2 大孔树脂及聚酰胺粉末预处理 称取一定量的大孔树脂，用95%乙醇浸泡24 h，再用酒精洗直至与3倍的蒸馏水混合不会变浑浊，然后用蒸馏水洗到无酒精味，取出备用[9]。

称取适量的聚酰胺粉末用无水乙醇煮沸2次，每次0.5 h，然后用湿法装柱，静置0.5 h再用蒸馏水洗，直到洗出液变为澄清，备用。

1.3.3 不同型号大孔树脂的筛选 取预处理好的等量不同型号的大孔树脂用湿法装柱（1 cm×20 cm），再用甲醇溶解5份0.5 g的总黄酮提取物，分别拌入1 g处理好的聚酰胺粉末，溶剂挥干后放置于漏斗中，用蒸馏水洗脱到流出液近无色，再将洗脱后的聚酰胺分别置于不同型号的大孔树脂柱上面，用60%乙醇溶液洗脱至无色。分别测定洗脱液中的固体量及其总黄酮的含量，计算总黄酮的得率和纯度。总黄酮得率（%）=（洗脱液中所含总黄酮量/上柱前提取物所含总黄酮量）×100%，总黄酮纯度（%）=（洗脱液中所含总黄酮量/洗脱液含固体量）×100%；表1列出了不同型号各树脂的结构性能。

1.3.4 上样量与聚酰胺用量比的确定 称取试验最佳的树脂5 g，湿法装柱。再分别称0.5 g的总黄酮提取物，用甲醇溶解后拌合以一定量的聚酰胺粉末，使提取物与聚酰胺用量比分别为1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1，水洗至无色后置树脂柱上部，以60%乙醇进行洗脱，收集各比例的洗脱液并测其相应指标。

1.3.5 上样量与树脂用量比的确定 称取0.5 g的总黄酮提取物，以提取物与树脂用量为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的比例进行湿法装柱。按已确定的上样量与聚酰胺最佳比例进行处理后用60%乙醇进行洗脱，收集各比例的洗脱液并测定其相应指标。

1.3.6 洗脱剂浓度的确定 称取0.5 g的总黄酮提取物，按上述已确定的上样量与聚酰胺最佳比例和上样量与树脂最佳比例上样后，分别用20%，40%，60%，80%的乙醇浓度洗脱，收集各浓度的洗脱液并测定其相应指标，确定最佳洗脱剂的浓度。

1.3.7 洗脱流速的确定 称取0.5 g的总黄酮提取物按已确定最佳的上样量与聚酰胺比例、上样量与树脂比例和洗脱剂浓度上样后，用60%的乙醇分别以1，2，3，4 mL·min-1的流速洗脱，收集各流速的洗脱液并测定其相应指标，确定最佳的洗脱速度。

1.3.8 洗脱剂用量的确定 称取预处理好的AB-8树脂4 g用湿法装柱，将其处理好的总黄酮提取物按上述最佳条件上样和洗脱，进行分段收集，每5 mL收集一份，共收集20份，然后测其总黄酮含量及相应指标并绘制其洗脱曲线，从而确定洗脱剂的最佳用量。

2 结果与分析

2.1 不同型号大孔树脂的筛选

由于聚酰胺分子筛和大孔树脂吸附的双重作用，聚酰胺初步纯化的供试液进入大孔树脂后将会进行更进一步的纯化。不同树脂的吸附性能和物理性质不同，对所需有效成分吸附的影响较大。由表2可以看出，在四种树脂中AB-8树脂纯化和富集总黄酮的纯度及得率方面的效果最佳，因此，本试验选用AB-8树脂与聚酰胺联用进行纯化。

2.2 上样量与聚酰胺用量比分析

由表3可知，随着上样量-聚酰胺用量比不断增大，在洗脱液中总黄酮的纯度和得率逐渐降低。这可能是因为聚酰胺的用量降低以后，在聚酰胺上吸附的杂质和总黄酮的量相应减少，同时在水洗脱除杂的过程当中，流失了大量的总黄酮所致。所以综合考虑总黄酮的纯度和得率，本试验选择1∶2的上样量与聚酰胺用量比。

2.3 上样量与树脂用量比分析

由表4可知，上样量一定时，上样量与树脂用量比为1∶8时总黄酮的纯度和得率都达到最大值。若树脂用量过少，就会超过树脂的饱和吸附量而使部分总黄酮损失而引起总黄酮的纯度和得率降低；随着树脂量不断增多，纯度和得率的变化不是很大，但是会使纯化的周期变长，生产成本也就相应的增高。所以最佳的上样量与树脂用量比例为1∶8。

2.4 乙醇洗脱浓度的确定

乙醇浓度对洗脱液中总黄酮的纯度和得率都有一定的影响。表5结果表明，随着乙醇浓度的增大，总黄酮的纯度和得率也逐渐升高，当乙醇浓度为60%时达到最高值；当乙醇的浓度大于60%后，总黄酮的纯度和得率变化趋于平缓，说明翅果油树叶片中的总黄酮已经基本被洗脱下来。考虑到洗脱剂的浪费，本实验选择用60%的乙醇为洗脱剂。

2.5 洗脱流速的确定

表6表明，洗脱流速为2 mL·min-1时，总黄酮的纯度和得率达到最大，能将总黄酮较完全的洗脱下来。当流速过快时，洗脱剂和树脂接触的时间比较短，树脂对洗脱剂中总黄酮的吸附率降低而导致其纯度和得率都下降；但当流速较慢时，则会使洗脱循环的周期变长，浪费洗脱剂。所以本试验选择2 mL·min-1的洗脱流速。

2.6 洗脱剂用量的确定

在洗脱的过程中，若洗脱剂用量较少，所需的成分就不会被完全洗脱下来，若洗脱剂较多则会造成试验成本的升高，也会给后续的浓缩干燥等处理带来困难。由表7可知，当洗脱剂的用量大于2 BV以后，总黄酮的得率变化不是很大反而纯度有所降低，绝大部分的总黄酮已经在2 BV时基本被洗脱下来。本着缩短时间和减少试验周期的原则，本试验选择2 BV的洗脱剂用量。

3 结 论

聚酰胺和大孔树脂是纯化黄酮类化合物的常用材料，由于二者吸附原理不同使其在分离纯化黄酮类化合物方面各有优缺点，但是把聚酰胺和大孔树脂联用就能充分发挥其优点。本试验采用聚酰胺-大孔树脂联用纯化菠菜叶总黄酮的最佳树脂为AB-8，其最佳纯化条件为：上样量与聚酰胺量之比为1∶2；上样量与树脂量之比为1∶8；乙醇洗脱的浓度为60%；洗脱流速为2 mL·min-1；洗脱剂的用量为2 BV，总黄酮收率最高可达71.42%，纯度可达26.63%。该方法优于目前常用的总黄酮的纯化方法且工艺简单，具有良好的应用前景。

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