刘 沁，张 兵，谢志萍，钟礼立，曾赛珍，刘淑萍，高寒春，肖霓光，谢乐云，熊 洁，段招军

（1. 南华大学，衡阳 421000；2.湖南省人民医院儿科，长沙 410005；3. 中国疾病预防控制中心与病毒生物技术国家工程研究中心，北京 100052）

急性下呼吸道感染（Acute Lower Respiratory Tract Infections, ALRTI）是儿童发病和死亡的主要原因，据WHO估计，2010年全球5岁以下住院儿童中约有1190万为ALRTI，约26.5万患儿发生院内死亡，并且99%发生在发展中国家［1］。同期在我国31.5万死亡儿童中肺炎所致的占17.4%［2］，呼吸道合胞病毒（respiratory syncytin virus，RSV）、鼻病毒（human rhinovirus，HRV）、流感病毒（influenza virus，IFV）、副流感病毒（parainfluenza，PIV）、腺病毒（adenovirus，ADV）等是引起儿童ALRTI的常见病毒病原，人偏肺病毒（human metapneumovirus，hMPV）、人博卡病毒（human bocavirus，HBoV）、人冠状病毒 HKU1（human coronavirus HKU1，HCoV-HKU1）、人冠状病毒NL63（human coronaviruses NL63，HCoVNL63）、肠道病毒 68型（enterovirus 68，EV68）等近年来也被认为与之相关［3，4］。目前聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是检测呼吸道病毒的主要方法，而实时荧光聚合酶链式反应（Real-time fluorescent polymerase chain reaction，RT-PCR）操作简单、快速、污染少，具有更强的临床实用性［5］。因此，本研究运用RT-PCR方法对湖南长沙地区2013年4月至2014年3月共603例ALRTI住院患儿的鼻咽抽吸物（nasopharyngeal aspirates，NPA）进行14种病毒检测，结合临床资料进行分析，以求为本地区儿童ALRTI的防治提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 以2013年4月～2014年3月在湖南省人民医院儿科医学中心住院，并符合《诸福棠实用儿科学》（第七版）诊断标准的ALRTI患儿为研究对象，其中男童371例，女童232例，男女比例为1.6：1，年龄为生后19小时至13岁，中位年龄为13月。临床诊断包括：急性支气管炎37例、肺炎341例、毛细支气管炎218例、支气管哮喘合并肺部感染7例。

1.2 方法

1.2.1 标本采集、运送及病历资料收集 采集入院48小时内患儿NPA，并加入与NPA等量病毒保护液，再予干冰保存转运至中国CDC病毒病所-80℃保存；标本采集前征得患儿父母的知情同意和医院伦理委员会的批准，患儿的临床资料均在病历中记录，在其出院后通过病历查阅获取。

1.2.2 标准品及探针引物的制备 14类病毒阳性标准品由中国CDC病毒病所提供，引物及探针均通过相关参考文献获得，所用引物终浓度为20μM，探针终浓度为10μM。

1.2.3 处理标本，提取核酸 将标本37℃水浴解冻，旋涡震荡至水样，4℃ 3700r/m in离心5min，取上清200μL，采用Qiampminelute Virus Spin Kit试剂盒提取200μL样本中病毒核酸，具体步骤见试剂盒说明书。

1.2.4 病毒核酸检测 采用One step RT-PCR Kit试剂检测RSV、HRV、IFVA-B、PIV1-4、hMPV、EV、HKU1、NL63共12种RNA病毒，Taqman Universal Master MixⅡwith UNG试剂检测ADV、HBoV共2种DNA病毒，实验结果标准曲线相关系数R2>0.99，扩增效率Eff%在90%～110%，每个循环的最后一步结束时进行荧光检测，由仪器自带软件计算出Ct值并给出定量结果，以病毒载量≥1×100copies/μL的标本视为阳性。

1.2.5 统计学处理 实验结果采用SPSS18.0对数据进行统计分析，各组间率的比较采用χ2检验和连续校正χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病毒检出状况分布特点 603份NPA标本中，527份检出了病毒，总检出率为87.4%，其中RSV列居首位，其次为HRV、HBoV及PIV3，各类病毒检出情况详见表1。

表1 病毒阳性检出状况（n=603）

2.2 病毒检出的性别分布特点 男性患儿371例，女性232例，男女检出率分别为88.1%（327/371）和87.1%（202/232），男女阳性检出率比较差异无统计学意义（χ2=0.152，P=0.697）。不同病毒阳性检出结果的性别分布及比较见表2，从表2中可以看出，14种病毒阳性检出率男女比较差异均无统计学意义。

2.3 病毒检出的年龄分布特点 从表3可见，不同年龄段病毒检出率不同，以6月～年龄段检出率最高，不同年龄段之间病毒检出率比较差异有统计学意义（χ2=45.982，P=0.000）。不同年龄段各病毒的检出率见表4，其中RSV在0月～年龄段检出率最高，HRV以12月～年龄段最高，PIV3在6月～年龄段为主。

表2 病毒阳性检出结果的性别分布及比较n（%）

表3 病毒阳性检出的年龄分布

表4 不同年龄段病毒检出率n（%）

2.4 病毒检出的季节分布特点 各病毒全年均有检出，但病毒总检出率季节分布差异有统计学意义（χ2=13.864，P=0.003），以冬季检出率最高95.8%。不同病毒的季节分布亦有明显不同，其中RSV的检出高峰在2013年12月至2014年3月，HRV在6月和9月至11月，HBoV在4月及7月有两个波峰，PIV3检出高峰在4、5月，ADV高峰集中在8月，而IFVA检出高峰在12月；其他详见图1和2。

2.5 不同临床诊断病毒检出率分布特点 在不同临床诊断中，病毒检出情况大致相同，其中急性支气管炎患儿中病毒总检出率为86.5%（32/37），肺炎的检出率为84.5%（288/341），毛细支气管炎为92.2%（201/218），支气管哮喘合并肺部感染的检出率为85.7%（6/7）。各诊断中不同病毒所占比例有所不同，急性支气管炎组患儿中HRV检出率（32.4%）居首；肺炎和毛细支气管炎患儿中RSV均占首位，检出率分别为40.2%、49%，详见图3。

2.6 单一或多重病毒检出状况分布特点 在527例病毒阳性检出患儿中，检出一种病毒的有276例，占52.4%，检出两种及两种以上混合病毒的有251例，占47.6%，详见表5。

表5 单一及两种混合病毒检出状况 n

图1 病毒阳性检出率季节分布情况

图2 病毒阳性检出率季节分布情况

图3 不同临床诊断病毒检出率分布

3 讨论

本研究结果显示603名ALRTI住院儿童病毒总检出率为87.4%，表明病毒感染在长沙地区ALRTI住院儿童中占有重要地位，其中RSV检出率最高42.6%，其次为HRV 25.4%、HBoV 17.7%、PIV3 15.4%及ADV14.46%，与本课题组前期研究及国内北京、广州、重庆地区［6-9］，以及国外ALRTI住院患儿病毒谱的构成状况相似［10-12］，也说明上述病毒为长沙地区ALRTI儿童主要的病毒病原。病毒总检出率87.4%较本课题组前期研究74.76%有所上升，考虑可能与实时荧光PCR检测方法灵敏度更强有关，也在一定程度上说明随着时间的推移，病毒在住院儿童ALRTI中所占地位愈发突出，因此进行连续动态病毒病原学监测显得尤为重要。

本组资料发现，患儿男女性别的病毒阳性检出率无差异，提示性别对病毒总体检出情况无明显影响，与本课题组前期研究相一致［6］。不同年龄段病毒检出率有不同，以6 个月至1 岁以内年龄段检出率最高，5岁以下患儿病毒总检出率90.2%（489/542），3岁以下90.5%（429/474），1岁以下96.5%（280/290），表明年龄愈小对病毒愈易感，与国内部分地区报道基本一致［6-9，13］。在不同年龄段内各病毒检出情况同样存在差异，RSV最常见于0月～小婴儿年龄段，PIV3最常见于6月～婴儿年龄段，而HRV则最常见于12月～幼儿年龄段，以上结果提示不同病毒病原对不同年龄段患儿易感性不同，可能与儿童呼吸道生理结构特点及机体免疫功能状况存在关联。

本研究还发现，各病毒检出率的高峰期季节分布有所不同，RSV、IFVA以冬季高发，HRV常见于夏秋季，PIV3常见于春季，ADV则集中在夏季；而北京地区的报道显示RSV、HRV高发于冬春季，ADV则集中在春季，PIV则集中在春夏季［7］；重庆地区RSV同样以冬季高发，PIV3、ADV则常见于春夏季，IFVA集中在夏季［9］；法国RSV集中在秋冬季，ADV、PIV及IFVA均集中在冬季［11］。上述资料说明，各病毒检出高峰的季节不同，可能与不同研究对象的地理位置、环境、气候条件及采样时期不同有关。

近年来，国内外文献均显示RSV为ALRTI住院儿童最常见的病毒病原，其流行年龄段集中在小年龄组患儿，以冬春季节高发［7，9，14，15］，上述特点与本研究基本相同。本组资料RSV的检出率为42.6%，明显高于本课题组前期（27.03%）的报道［6］，考虑与本研究期间可能存在RSV流行趋势有关，说明连续动态监测的重要性，但也不排除与实时荧光PCR检测方法灵敏度更高有关。HBoV在本组资料中检出率17.7%列居第三位，明显高于前期数据（8.67%）［6］及上海、约旦、韩国（5.45~9.1%）的检出率［16-18］，但与日本（15.7%）的检出率接近［19］，而该研究与本研究的检测方法一致。本资料显示HBoV以混合感染为主，占总阳性率的86%，且春、夏季有双峰流行。本研究还发现ADV（14.8%）及IFVA（7.5%）的检出率较2007~2008年长沙地区（ADV4.46%，IFVA1.95%）的数据显著增高［6］，说明本研究期间内这2种病毒在本地区有爆发流行，近年来国内外也有相关报道［20-23］，值得高度重视。

本研究采用实时荧光PCR检测手段对长沙地区603名ALRTI住院儿童的NPA进行病毒核酸检测，了解了本地区2013~2014年ALRTI住院儿童病毒病原的流行病学特点，为临床医师在实际工作中经验性治疗提供了科学依据，同时也为卫生行政部门防控决策积累参考资料。

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