郭亚焕，陆建荣，廖子君，张彦兵

论著·临床

自噬相关蛋白Beclin1和LC3在结肠癌组织中的表达及临床意义

郭亚焕，陆建荣，廖子君，张彦兵

目的 探讨自噬相关蛋白Beclin1和LC3在结肠癌组织中的表达及临床意义。方法 收集2011年1月—2014年1月结肠癌患者80例，取结肠癌组织标本及相应的正常组织标本各80份。用免疫组化法检测结肠癌和正常结肠组织中自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达,分析二者和结肠癌临床病理学参数，包括年龄、分化程度、TNM分期和淋巴结转移等的关系。结果 结肠癌和正常结肠组织中Beclin1的阳性表达率分别为33.8% (27/80)、73.8% (59/80)，LC3阳性表达率分别为22.5% (18/80)、68.8% (55/80)，Beclin1和LC3在结肠癌的阳性表达率显著低于正常结肠组织(P<0.01)。不同年龄、分化程度结肠癌组织中Beclin1和LC3的表达差异无统计学意义(P>0.05)，而不同TNM分期(P<0.01)和淋巴结转移结肠癌组织中Beclinl和LC3表达差异有统计学意义(P<0.01)。结论 自噬相关蛋白Beclin1和LC3的低表达可能与结肠癌的发生发展和预后不良有关。

结肠癌；Beclin1；LC3；自噬；免疫组化

结直肠癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，发病率居男性恶性肿瘤第3位和女性第2位，不同地区发病率和病死率差异较大，我国为大肠癌的高发地区，在2012年公布的数据中，我国结直肠癌新发病例数为25.3万例，占全球大肠癌新发病例的18.6%[1]。早期大肠癌主要以手术为主，术后复发和转移是治疗失败的原因，不良预后因素主要包括年龄、病理分期晚、低分化、淋巴结转移、脉管瘤栓等，但是这些因素是否能够精确判断预后目前尚无定论，因此，研究大肠癌的分子生物学特征及与预后的关系成为目前的研究重点。自噬(autophagy)是细胞降解被损害的细胞器和蛋白质的过程，与肿瘤的发生发展密切相关，在肿瘤发展的不同阶段发挥不同的作用。Beclinl蛋白含有BH3结构域, LC3基因是哺乳动物中酵母ATGS基因的同源物, 两者均在哺乳动物的自噬泡形成过程中发挥重要作用[2～6]。

现分析自噬相关蛋白Beclin1和LC3在结肠癌和正常结肠组织中的表达差异，及二者与结肠癌临床病理学参数的关系，探讨自噬与结肠癌发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 (1)组织标本： 收集陕西省肿瘤医院2011年1月—2014年1月治疗的结构癌患者80例，所有患者均接受结肠癌根治术，均经病理确诊为结肠腺癌。患者男48例，女32例，年龄29～79岁，中位年龄50岁。每例均取结肠癌组织标本及相应的正常结肠组织标本。(2)主要试剂：Beclin1小鼠抗人单克隆抗体和LC3B兔抗人单克隆抗体，二抗生物素化山羊抗小鼠IgG/兔IgG均购自Abcam(USA)；链霉亲和素—生物素复合物(SABC)试剂盒和DAB显色液均购自武汉博士德生物工程有限公司。(3)倒置显微镜：奥林巴斯(CKX41-A32RC)购自奥林巴斯(北京)销售服务有限公司。

1.2 观测方法 采用免疫组化SABC法，所有标本均应用10%的福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚度4 μm；将石蜡组织切片放置在60℃烘箱内烘烤60 min；石蜡切片常规脱蜡、脱水、水化；3%过氧化氢去离子水封闭，室温下孵育20 min，以去除内源性过氧化物酶活性；柠檬酸盐缓冲液高压热修复；山羊血清封闭，37℃下孵育40 min；一抗(Beclin1和LC3B 1∶200)4℃冰箱孵育过夜；生物素化山羊抗小鼠IgG/兔IgG，37℃下孵育30 min；SABC，37℃下孵育30 min；DAB显色；苏木素复染；酒精脱水；二甲苯透明；中性树胶封片。阴性对照以PBS代替一抗。

1.3 结果判定 由2位病理科医生采用盲法独立阅片，Beclin1和LC3均为胞浆表达，阳性染色为棕黄色均匀染色，倒置显微镜(10×20倍)镜下随机选取5个视野，每个视野分别计数阳性细胞数，评分标准[7]：0分, 无或有弱的染色; 1分, 平均阳性细胞数与总计数细胞的比例≤30%; 2分,平均阳性细胞数与总计数细胞的比例>30%。染色强度评分标准：0分, 阴性;1分, 淡黄色; 2分, 黄色; 3分, 棕黄色。蛋白表达的分级：阳性细胞百分数评分与染色强度评分的乘积： 0～1分为阴性；低表达2～4分为高表达：5～6分为阳性[7]。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Beclin1和LC3在结肠癌和正常结肠组织的表达率 结肠癌和正常结肠组织中Beclin1的阳性表达率分别为33.8%(27/80)、 73.8%(59/80)，结肠癌显著低于正常结肠组织(χ2=25.745，P=0.000)；LC3阳性表达率分别为22.5% (18/80)、 68.8% (55/80)，结肠癌显著低于正常结肠组织(χ2=34.489，P=0.000)。见表1，图1(见封3)。

表1 Beclin1和LC3在结肠癌和正常结肠组织的表达率 [例(%)]

2.2 Beclin1和LC3的表达与结肠癌临床病理学参数的关系 不同年龄、肿瘤分化程度结肠癌患者均无统计学意义(P>0.05)；不同pTNM分期和淋巴结转移患者Beclin1的表达，差异有统计学意义(P<0.01)。不同年龄、肿瘤分化程度结肠癌患者LC3的表达差异均无统计学意义(P>0.05)；不同pTNM分期和淋巴结转移患者，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

3 讨 论

目前普遍认为在多种类型的恶性肿瘤中均存在自噬活性的异常，在肿瘤发生的早期，自噬受抑将导致氧化磷酸化解耦联的线粒体等衰老损伤的细胞器堆积，ROS等致癌物质产生增多，导致染色体的不稳定性增加，使抑癌基因失活或癌基因被激活，导致细胞的恶性转化；在肿瘤进展的晚期，随着肿瘤体积的不断增大，细胞处于乏氧和营养缺乏的状态，此时自噬激活作为一种生存机制维持肿瘤细胞在不利环境下的存活，促进肿瘤的生长[8]。

表2 Beclin1和LC3的表达与结肠癌临床病理学参数的关系 [份(%)]

本结果显示Beclin1和LC3在结肠癌的阳性表达率显著低于正常结肠组织，提示肿瘤组织的自噬活性显著降低。目前一些研究有类似的结果，Zhu等[9]采用免疫组化法检测Beclin1和LC3蛋白在宫颈鳞癌和正常宫颈组织的表达，结果显示宫颈癌组织Beclin1和LC3的表达显著低于正常宫颈组织。有学者研究发现乳腺癌Beclin1和LC3的表达低于正常乳腺组织，Beclin1基因的过表达抑制乳腺上皮细胞的恶性转化；而Beclin1基因的下调促进了乳腺上皮细胞的癌变[10]。Jiang等[11]的研究发现与正常肺组织比较，Beclin1和LC3的表达在肺癌组织显著降低。基于我们的研究和上述报道，我们认为自噬活性的降低与结肠癌的发生有关，自噬可能是阻碍肿瘤发生的屏障，在肿瘤进展的早期，自噬的缺陷会使细胞维持内环境稳定的能力降低，导致细胞恶变的几率增加，促进恶性肿瘤的发生。但是，目前还有一些研究发现肿瘤组织的自噬活性增强，Wu等[12]的研究表明结肠癌组织Beclin1和LC3的表达与邻近正常组织比较显著增高，Park等[13]的研究显示胆囊癌组织Beclin1和LC3的表达显著高于正常胆囊组织。这些不同的结果可能与自噬对细胞的双重作用有关，在癌变的早期，自噬水平下降使癌基因活化和抑癌基因失活，使细胞中过多堆积衰老的细胞器，导致正常细胞转化为癌细胞。而在恶性肿瘤发展的晚期，由于癌细胞不断生长和增殖，细胞内部出现营养缺乏和缺氧的状况，并且癌细胞自身代谢水平较高，对能量和营养的需求较高，此时微环境的压力使癌细胞内的自噬激活，维持癌细胞在不利环境下的生存，并且不同类型肿瘤的自噬能力在其发展的不同阶段也存在很大差异[14，15]。

本结果显示Beclin1和LC3的表达与淋巴结转移和TNM分期呈负相关， 有学者在胃癌中观察到了类似的结果[16]，提示自噬活性的减低促进了恶性肿瘤的淋巴结转移。在恶性肿瘤进展的晚期，细胞内的自噬在微环境的压力下被激活，使肿瘤细胞在缺氧和营养缺乏的条件下生存能力提高，并获得了更强的转移能力。值得注意的是，目前自噬与肿瘤发生发展的关系尚未完全明确，不同的肿瘤类型，不同的发展阶段细胞具有不同的自噬能力，对预后会产生不同的影响，因此，开展更多大样本的研究明确自噬在肿瘤发生发展中的作用是十分必要的。

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15 Viry E,Paggetti J,Baginska J,et al.Autophagy: an adaptive metabolic response to stress shaping the antitumor immunity[J].Biochem Pharmacol,2014,92(1):31-42.

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Expressions and clinical significance of autophagy related protein Beclin1 and LC3 in colon cancer

GUOYahuan*,LUJianrong,LIAOZijun,ZHANGYanbing.*DepartmentofMedicalOncology,TumorHospitalofShanxiProvince,Xi’an710061,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of autophagy related protein Beclin1 and LC3 in colon cancer tissues.Methods Eighty cases of colon cancer patients were collected from January 2011 to January 2014, 80 cases of colon cancer tissues and corresponding normal tissues were collected. The expression of autophagy related proteins LC3 and Beclin1 in colon cancer and normal colon tissues were detected by immunohistochemical method, and the relationship between protein Beclin1 and LC3 and age, differentiation, TNM stage and lymph node metastasis were analyzed.Results Positive expression rate of Beclin1 in colon carcinoma and normal colon tissue were 33.8% (27/80) and 73.8% (59/80), LC3 positive expression rate was 22.5% (18 / 80), 68.8% (55 / 80), Beclin1 and LC3 positive expression in colon cancer rate was significantly lower than that in normal colon tissue (P<0.01). Different age, degree of cancer tissue’s Beclin1 and LC3 expression had no statistical significance differences (P>0.05), and different TNM staging (P<0.01) and lymph node transfer in the colorectal cancer tissue’s Beclin1 and LC3 expression showed statistically significant differences (P<0.01).Conclusion Low expression of autophagy related proteins Beclin1 and LC3 may be related to the development and prognosis of colon cancer.

Colon cancer; Beclin1; LC3; Autophagy; Immunohistochemistry

陕西省科学技术研究发展计划项目(No.2011JM4005)

710061 西安，陕西省肿瘤医院内一科(郭亚焕、廖子君、张彦兵)，病理科(陆建荣)

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.10.018

2015-06-26)