刘志勤，任婧婧，张卫萍，杜晶晶，贾晓涛，王新来

论著·临床

汉族急性缺血性脑卒中患者CYP2C19基因多态性与氯吡格雷抵抗的多因素分析

刘志勤，任婧婧，张卫萍，杜晶晶，贾晓涛，王新来

目的 分析汉族急性缺血性脑卒中患者CYP2C19基因多态性与氯吡格雷抵抗的关系。方法 2012年7月—2014年9月连续性纳入住院并服用氯吡格雷抗血小板聚集治疗(75 mg/d，连续>7 d)的急性缺血性脑卒中患者72例。根据对二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集抑制率将患者分为氯吡格雷抵抗(CR)组(27例)和非抵抗(NCR)组(45例)。基因芯片法检测受试者的CYP2C19基因型，依据突变类型，分为快代谢型(*1/*1)、中间代谢型(*1/*2、*1/*3)和慢代谢型(*2/*2、*2/*3、*3/*3)。采用多元Logistic回归分析筛选与发生氯吡格雷抵抗相关的危险因素。结果 2组CYP2C19基因型的分布比较差异有统计学意义(χ2=32.302，P<0.05)；检出CYP2C19基因型为慢代谢型7例(9.7%)，中间代谢基因型39例(54.2%)，快代谢型26例(36.1%)；3组的血小板聚集抑制率分别为(67.5±21．6)%、(57．6±23．4)%和(31.4±15.1)%，慢代谢型>中间代谢型>快代谢型(P<0.01)。多因素Logistic回归分析结果显示CYP2C19慢代谢型(*2/*2、*2/*3)(OR=7.802，95%CI 1.412～40.304,P=0.018)和低密度脂蛋白水平>2.6 mmol/L(OR=3.923，95%CI 1.314～17.927,P=0.032)是发生氯吡格雷抵抗的独立危险因素。结论 汉族急性缺血性脑卒中患者中，CYP2C19慢代谢基因型(*2/*2、*2/*3)和低密度脂蛋白水平升高是导致氯吡格雷抵抗的独立危险因素。

CYP2C19基因多态性；氯吡格雷；抵抗；多因素分析

氯吡格雷目前被广泛应用于预防高危卒中的复发，我国缺血性卒中治疗指南都明确提出：对于非心源性缺血性卒中患者的二级预防，氯吡格雷可作为单用或联合用药的选择[1]；但研究发现，在接受规范氯吡格雷治疗的缺血性卒中患者中，每年仍有不少卒中再发事件[2]，氯吡格雷抵抗(CR)是指氯吡格雷用于部分缺血性疾病患者时其抗血小板聚集作用降低或消失，患者仍发生血栓事件的现象。目前的研究认为，氯吡格雷体内相关过程蛋白细胞色素 P450基因多态性是导致氯吡格雷抵抗发生的重要因素,其CYP2C19*2和CYP2C19*3突变是汉族人群的主要突变类型[3]。氯吡格雷抵抗可能与基因多态性等多种因素相关，但尚无定论，本研究旨在考察汉族人群CYP2C19基因多态性与缺血性脑卒中患者氯吡格雷抵抗的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012年7月—2014年9月西安市中心医院神经内科确诊的急性缺血性脑卒中患者72例，均符合中国急性缺血性卒中诊治指南认定的急性脑梗死标准[4]。其中男52例，女20例，年龄35～76(64.8±9.6)岁。发病时间7～14 d。根据对二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)诱导的血小板聚集抑制率将患者分为氯吡格雷抵抗(CR)组和非抵抗(NCR)组。CR组27例，NCR组45例。2组患者一般临床特征详见表1。

表1 CR与NCR组主要基线特征的比较

1.2 纳入与排除标准 (1)纳入标准：①年龄18～80岁；②依据中国急性缺血性卒中诊治指南认定的急性脑梗死患者；③连续服用氢氯吡格雷(波立维)75 mg≥7 d；④签署知情同意书。(2)排除标准：①血小板计数(PLT) < 100×109/L ；②近1个月内有应用其他抗血小板聚集药物或抗凝药物史；③近3个月内有活动性出血史，或伴有出血性血液病、恶性肿瘤等；④严重肝、肾功能异常: 超过正常上限的50%； ⑤近1个月内有外科大手术史；⑥同时应用质子泵抑制剂类药物的患者。

1.3 药物治疗 所有患者均口服氯吡格雷(赛诺菲安万特制药有限公司生产)75 mg/d，连续使用7 d以上，患者入组后均联用阿托伐他汀(辉瑞制药公司生产)20 mg/d。所有患者同时给予依达拉奉注射液(吉林博大制药公司生产)30 mg静脉注射，2次/d,连续治疗14 d。其余治疗依据中国脑血管病急性期治疗指南对症处理。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 基线资料： 记录入选患者的人口学特征、用药情况，既往史(高血压、卒中、房颤、糖尿病、高脂血症)，血压，血糖，NIHSS评分，磁共振血管成像(MRA)、数字减影血管造影(DSA)等血管学检查，卒中TOAST分型，合并用药情况。

1.4.2 血小板聚集功能测定： 连续服用氯吡格雷75 mg/d，7 d后，抽取空腹肘静脉血3 ml(抗凝血)，采用光学比浊法血小板聚集试验测定血小板聚集率，采用美国HELENA四通道血小板聚集仪和诱导ADP(50 μmmol/L，美国Sigma公司)分别在氯吡格雷服药前、服药后10～14 d时测定小板聚集率。要求在送检后3 h内完成。参照Gurbel等[5]提出的氯吡格雷抵抗评价标准：以服用氯吡格雷前后ADP诱导的血小板聚集率的差值≤10%判定氯吡格雷抵抗。

1.4.3 基因型检测： 采集受试者3 ml静脉血EDTA抗凝管-20℃保存，集中DNA提取和基因检测。CYP2C19基因型检测采用西安金磁纳米科技有限公司CYP2C19基因检测试剂盒(PCR-金磁微粒层析法，试剂型号：REF0011)。操作(AS-PCR法)[6]：制备样本DNA，准备聚合酶链反应(PCR)扩增液，进行PCR扩增，杂交显色。反应结束后，取出芯片，将芯片放入生物芯片识读仪中，用基因芯片图像分析软件进行图像扫描与数据分析，输出检测结果。最终输出6种基因型：*1/*1 基因型为快代谢型，*1/*2 或*1/*3 基因型为中间代谢型，*2/*2、 *3/*3 或*2/*3 基因型为慢代谢型[7]。

2 结 果

2.1 不同基因型分布比较 通过对CR组与NCR组CYP2C19基因型构成比统计分析发现，2组间基因型构成比差异有统计学意义(χ2=32.302，P<0.05)，见表2。

2.2 不同代谢型血小板聚集率比较 检出CYP2C19基因型为慢代谢型7例(9.7%)，中间代谢基因型39例(54.2%)，快代谢型26例(36.1%)；3组的血小板聚集抑制率分别为(67.5±21．6)%、(57．6±23．4)%和(31.4±15.1)%，慢代谢型>中间代谢型>快代谢型(F=35.23，P<0.01)。

2.3 多因素分析 以CR为因变量，以可能危险因素为自变量进行多元Logisticc回归分析，结果显示，CYP2C19慢代谢型(*2/*2、*2/*3)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平是发生CR的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 氯吡格雷抵抗的多因素logistic回归分析结果

3 讨 论

3.1 CYP2C19基因多态性与氯吡格雷抵抗的相关性 细胞色素P450 2C19(CYP2C19)是氯吡格雷氧化代谢作用的关键酶，人群中CYP2C19基因的多种不连续突变等位基因，称之为基因多态性。目前已知的CYP2C19等位基因有36个，其中野生型是CYP2C19*1/*1(快代谢)，其编码有完全活性的酶；最常见的突变位点是核苷酸序列变异为CYP2C19 681G>A的CYP2C19*2，约占所有变异的95%，该位点变异约占东亚人种的55%[8]； CYP2C19*3也是常见的变异等位基因，约见于7%的东亚人，核苷酸序列为CYP2C19 636 G>A。Liu等[9]针对PCI术后患者的研究发现携带至少1个变异型CYP2C19*2/*3等位基因的患者，1年内支架内血栓形成的风险是纯合野生型的3.65倍 (95% CI 1.07～12.38，P=0.038)。国内杨莉萍等[10]的系统评价发现，CYP2C19*2/*3基因携带者发生支架内血栓的风险显著增加(P<0.01),与CYP2C19*1基因携带者相比，相对危险度增加了92%(P<0.01)。目前多数研究支持CYP2C19突变基因携带与CR的发生密切相关。

3.2 CYP2C19基因多态性分布 张爱玲等[3]对亚洲人群CYP2C19基因突变率的荟萃分析发现，中国人群中CYP2C19*1/*1、*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3和*3/*3基因型发生率分别为37.2%、41.4%、6.7%、9.9%、4.1%和0.7%；本课题组发现西安地区汉族人上述各基因型突变发生率分别为36.1%、43.1%、11.1%、6.9%、2.8%、0%。总体基因频率与国内外报道一致，我们的研究中无*3/*3纯合子突变个体，可能与本组相对样本量偏小有关。因此，CYP2C19*2是汉族人群中CYP2C19基因突变的最常见类型。

3.3 CR相关危险因素 目前国内外研究均证实，CYP2C19基因突变与CR关系密切[11]，大多数研究集中在PCI后支架内血栓形成。Jia等[12]的研究显示CYP2C19基因多态性和氯吡格雷治疗急性缺血性卒中发生CR独立相关；本课题组亦通过多因素回归分析证实CYP2C19慢代谢基因型突变(*2/*2、*2/*3)是导致CR的独立危险因素(OR=7.802，95%CI 1.412～40.304,P=0.018)，与上述报道一致。本研究发现卒中人群发生CR的比率为37.5%，高于国内福建地区陈枝庭等[13]26.5%的报道，但低于北京地区赵清等[14]报道的58.8%的CR发生率，提示CR的发生除了受到CYP2C19基因多态性的影响之外可能受到药物相互作用，血脂、基线血糖、吸烟史、卒中史等其他因素的影响[15]。因此，寻找CR发生的其他潜在危险因素对减少其发生有重要临床价值。本研究发现LDL-C 与CR存在独立相关性，提示严格控制低密度脂蛋白对减少CR具有重要意义。

3.4 药物治疗 由于CYP2C19基因多态性与CR之间存在密切的相关性，Panattoni等[16]的研究指出，增加氯吡格雷剂量可提高缺陷性CYP2C19变异基因携带者的抗血小板聚集效果,从而减少CR的发生。Rossi等[17]的研究显示基于CYP2C19基因筛查调整剂量的氯吡格雷治疗减少了CR的发生。但目前的研究样本量过小，需要大样本研究的进一步证实。

综上所述，目前研究业已明确CYP2C19*2 基因位点突变与CR关系最为密切，我们的研究亦证实汉族人群CYP2C19基因突变以*2位点最为常见，并与CR的发生独立相关。此外，本研究发现LDL-C 水平与氯吡格雷抵抗存在独立相关性，提示降低低密度脂蛋白对减少氯吡格雷抵抗，减少卒中复发至关重要。

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Multivariate analysis of the correlation between the gene ploymorphisms of CYP2C19 and clopidogrel’s resistance in Han nationality acute ischemic stroke patients

LIUZhiqin*,RENJingjing,ZHANGWeiping,DUJingjing,JIAXiaotao,WANGXinlai.*DepartmentofNeurology,Xi’anCentralHospital,Xi’anJiaotongUniversity,ShanxiProvince,Xi’an710003,China

Correspondingauthor:ZHANGWeiping,E-mail:909990451@qq.com

Objective To analyze the relationship between CYP2C19 gene polymorphism and clopidogrel resistance in acute ischemic stroke patients.Methods From July 2012 to September 2014, 72 consecutive patients with acute ischemic stroke (75 mg/d, continuous >7 d) who were hospitalized and treated with clopidogrel. According to the inhibition rate of platelet aggregation induced by ADP, they were divided into clopidogrel resistance (CR) group (27 cases) and non-resistant (NCR) group (45 cases). Gene chip method was used to detect the CYP2C19 genotype of the subjects. According to the type of mutations, the gene chip was divided into fast metabolic type (*1/*1), intermediate metabolism (*1/*2, *1/*3) and slow metabolism (*2/*2,*2/*3, *3/*3). The risk factors associated with the occurrence of clopidogrel resistance were analyzed by multiple Logistic regression analysis.Results The CYP2C19 genotype distribution were statistically significant different between the two groups (χ2=32.302,P<0.05); detected CYP2C19 genotypes were slow metabolism in 7 cases (9.7%), intermediate metabolic genotype 39 cases (54.2%), fast metabolism type in 26 cases (36.1%), 3 groups of platelet aggregation inhibition rate respectively were (67.5±21.6)%, (57.6±23.4)% and (31.4±15.1)%, slow metabolism type > intermediate metabolizers > metabotropic (P<0.01). Multivariate logistic regression analysis showed that CYP2C19 slow metabolizers (* 2 / * 2, *2/*3) (OR=7.802, 95% CI 1.412 to 40.304,P=0.018) and low density lipid protein levels >2.6 mmol / L (OR=3.923, 95% CI 1.314 to 17.927,P=0.032) was independent risk factors for clopidogrel resistance.Conclusion In patients with acute ischemic stroke, CYP2C19 (*2/*2, *2/*3) and low density lipoprotein levels were the independent risk factors for clopidogrel resistance.

CYP2C19 gene polymorphism; Clopidogrel; Resistance; Multivariate analysis

陕西省科学技术发展计划资助项目(No.2014K11-02-03)

710003 西安交通大学附属西安市中心医院神经内科(刘志勤、张卫萍、杜晶晶、贾晓涛、王新来);西安市血液病 研究所(任婧婧)

张卫萍，E-mail:909990451@qq.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.10.007

2015-06-08)