庾楠楠 李 华 李 军 肖 争 向玉琼 赵祝叶 尤燕华 刘 虹 孙 林 彭佑铭 刘伏友 李 瑛



蛋白磷酸酶2Ac介导Smad3中间连接区去磷酸化促肾小管上皮细胞间充质转分化的研究

庾楠楠*李 华*李 军 肖 争 向玉琼 赵祝叶 尤燕华 刘 虹 孙 林 彭佑铭 刘伏友 李 瑛

目的：通过蛋白磷酸酶2Ac(PP2Ac)过表达和小干扰RNA质粒转染人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)后予以转化生长因子β1(TGF-β1)刺激，观察PP2Ac对细胞外基质合成、肾小管上皮细胞间充质转分化(EMT)和Smad3中间连接区磷酸化的影响，探讨PP2Ac促肾间质纤维化的机制。 方法：常规培养HK-2细胞，分为对照组、TGF-β1组和质粒转染+TGF-β1组。采用RT-PCR和Western Blot法检测PP2Ac、纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E选择素(E-cadherin)表达水平。采用Western blot法检测Smad3、Smad3中间连接区pSmad3-L(pSer204)和pSmad3-L(pSer208)表达情况。 结果：RT-PCR和Western Blot结果均显示：PP2Ac过表达质粒转染HK-2细胞再予TGF-β1刺激24h后，PP2Ac表达较TGF-β1组升高，同时FN、Col-Ⅰ和a-SMA表达明显上调，E-cadherin表达下调；而PP2Ac小干扰RNA转染HK-2细胞后再予TGF-β1刺激24h，较TGF-β1组，PP2Ac表达降低，FN、Col-Ⅰ和α-SMA表达减少，E-cadherin表达增高(P<0.05)。Western Blot结果显示：TGF-β1刺激HK-2细胞1h时PP2Ac和Smad3中间区磷酸化的蛋白表达均达到峰值；HK-2细胞转染PP2Ac过表达质粒再予TGF-β1刺激1h后，与单纯TGF-β1刺激组比较，核蛋白中pSmad3-L(pSer204)和pSmad3-L(pSer208)表达均下降；而PP2Ac小干扰RNA转染HK-2细胞再予TGF-β1刺激1h后，核蛋白中pSmad3-L(pSer204)和pSmad3-L(pSer208)蛋白表达均增加(P<0.05)。 结论：PP2Ac促进肾小管上皮细胞外基质的生成及EMT；PP2Ac介导肾小管上皮细胞Smad3中间连接区去磷酸化。

蛋白磷酸酶2Ac 去磷酸化 细胞外基质合成 EMT Smad3中间连接区

转化生长因子β1(TGF-β1)被认为是调节肾小管间质纤维化最重要的因子之一[1]，其主要通过TGF-β/Smad经典信号通路调控肾间质纤维化，而Smad3被认为是介导TGF-β 信号转导的关键因子[2]。Smad3蛋白c末端磷酸化可正向调控TGF-β 信号转导。然而，新近研究发现，曾认为无特殊功能的Smad3中间连接区(linker region L区)亦可通过非Smad途径磷酸化，抑制TGF-β信号的转导，阻断下游靶基因的转录[3-4]。蛋白磷酸酶(PP)可发挥去磷酸化作用而参与可逆性磷酸化这一蛋白翻译后修饰方式。Heikkinen等[5]通过在缺氧环境下培养宫颈癌上皮细胞(Hela细胞)发现，PP2A在缺氧环境下可特异性使Smad3中间连接区去磷酸化。……