邱慈鑫 陈泽荣 陈晨 杨树华 李楠 王和鸣

【摘 要】目的：探讨温阳补肾方含药血清对破骨细胞凋亡率及RANK蛋白的影响。方法：体外诱导破骨前体细胞系RAW264.7向破骨细胞分化，分别用温阳补肾方低、中、高剂量含药血清和生理盐水血清干预，通过流式细胞术检测各组凋亡率，Western Blot检测各组RANK蛋白水平。结果：与空白对照组

比较，温阳补肾方含药血清可诱导破骨细胞凋亡（P = 0.000），降低破骨细胞RANK蛋白的表达（P = 0.000）。结论：温阳补肾方含药血清可诱导破骨细胞凋亡，温阳补肾方高剂量效果最佳。

【关键词】 破骨细胞；凋亡；RANK蛋白；温阳补肾方；含药血清；激素性股骨头坏死

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.05.002

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effects of serum medicated with Wenyang Bushen Formula（温阳补肾方） on osteoclast apoptosis rate and RANK protein.Methods：Differentiation in vitro was made from the osteoclast precursor cells RAW264.7 to osteoclast，which was interfered respectively with low，medium and high dose of Wenyang Bushen Formula and normal saline serum.The flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of each group，and the Western Blot was used to detect the level of RANK protein in each group.Results：Compared with the blank control group，serum medicated with Wenyang Bushen Formula could induce apoptosis of osteoclasts（P = 0.000），and reduce the expression of osteoclast RANK protein（P = 0.000）.Conclusion：Serummedicated with Wenyang Bushen Formula can induce apoptosis of osteoclasts，high dose of which is the best.

【Keywords】 osteoclasts；apoptosis；RANK protein；Wenyang Bushen Formula（温阳补肾方）；serum medicated；steroid-induced avascular necrosis of the femoral head

前期研究表明，温阳补肾方在临床上对激素性股骨头坏死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）早期疗效显著，温阳补肾中药能通过提高SANFH兔股骨头组织中骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、血管内皮生长因子的表达刺激成骨细胞，通过抑制RANK的表达影响破骨细胞的功能及活性[1-2]，并且温阳补肾中药某些化学成分直接作用于成骨细胞，促进其增殖[3-4]，以治疗SANFH。本实验进一步从温阳补肾方对体外培养破骨细胞凋亡率的影响方面加以探讨。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康SPF级4周龄Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量（200±20） g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：2007000556492。

实验中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求。

1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清、DMEM（Gibco公司）；TRAP染色试剂盒（GENMED公司）；细胞核因子κB受体活化因子配基（RANKL）和巨噬细胞刺激集落因子（M-CSF）（R&D公司）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基公司）；电泳仪（BIO-RAD公司）；二氧化碳细胞培养箱（Thermo公司）；倒置显微镜（Leica公司）。

2 方 法

2.1 温阳补肾方含药血清的制备 温阳补肾方组成：巴戟天15 g、骨碎补9 g、鹿角胶6 g、淫羊藿9 g、丹参9 g、郁金9 g、三七3 g、牛膝9 g、黄芪15 g、甘草3 g。由福建省第二人民医院制剂室加工制成，每毫升含生药2.5 g，高温封瓶，4 ℃保存备用。将60只Wistar大鼠随机分为空白对照组，温阳补肾方低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组15只。根据“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算各组大鼠等效剂量。温阳补肾方低剂量组每只灌胃4.35 g·kg-1·d-1生药，中剂量组每只灌胃8.70 g·kg-1·d-1生药，高剂量组每只灌胃17.40 g·kg-1·d-1生药，空白对照组用等量生理盐水灌胃。每日早、晚各1次，连续灌胃7 d。末次灌胃2 h后，用质量分数为10%的水合氯醛[0.3 mL·（100 g）-1]腹腔麻醉后腹主动脉采血，2000 r·min-1离心15 min，分装过滤除菌后-20 ℃冰箱保存备用。

2.2 破骨细胞诱导及鉴定 将RAW264.7前体细胞按每孔5×104密度接种于6孔板中，加入完全培养液（含20 ng·mL-1 M-CSF+40 ng·mL-1 RANKL诱导因子及质量分数为10%的胎牛血清），37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，每2天换液1次。每天用倒置相差显微镜动态观察培养前体细胞生长及分化情况。培养5 d后，做破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色鉴定。按照TRAP试剂盒说明书配置染色液，PBS冲洗待测细胞后加染色液，1组加PBS代替染色液为阴性对照组，37 ℃孵育1 h后观察。

2.3 流式细胞术检测各组破骨细胞凋亡率 将破骨细胞接种于6孔培养板，共接种24孔，加入各组培养基后培养48 h。将各组细胞培养液吸出至各个BD管内，再用PBS洗涤细胞1次，加入适量胰酶细胞消化液（不含有EDTA）消化细胞。室温孵育2 min，轻轻将贴壁破骨细胞吹打下来，防止过度消化，迅速将细胞混悬液移入有培养液的流式管，3000 r·min-1离心3 min后弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取3×105重悬的细胞，1000 r·min-1离心5 min后弃上清，加入500 μL Binding Buffer混匀后，加入5 μL Annexin V-FITC，再加入5 μL Propidium Iodide混匀；室温避光反应10 min；60 min内进行流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.4 RANK蛋白测定 各组接种于6孔板，每组6孔，各组含药血清培养48 h后，用细胞刮刀将细胞移入蛋白裂解液。加入5X SDS-PAGE loading buffer，水煮变性蛋白，冷却后-20 ℃保存备用。经蛋白定量后，各组取等量蛋白上样进行SDS-PAGE。将载有各组蛋白的PVDF膜投入含质量分数5%的脱脂奶粉/BSA封闭缓冲液中，室温摇床孵育2 h。加入1∶800稀释的RANK一抗，4 ℃过夜。去掉一抗溶液，洗液TBS-T洗膜3次，每次10 min。加入1∶5000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG抗体，37 ℃摇床孵育1 h。去掉二抗溶液，用洗液洗膜5次，用凝胶图像处理系统进行分析，测出各组蛋白相对表达量。

2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量数据以表示，各组数据的统计分析采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 诱导破骨细胞观察及鉴定 RAW264.7细胞通过M-CSF+RANKL联合诱导5d后，出现大量不规则形多核细胞，细胞核呈圆形或椭圆形，染色质颗粒细小，分布均匀，胞浆伸出许多细长的伪足样突起，见图1（1）。TRAP染色结果示，细胞胞浆部位可见紫红色沉淀，细胞核染色成阴性，而阴性对照组则未见紫红色，见图1（2）、图1（3）。提示RAW264.7细胞通过M-CSF+RANKL联合诱导5 d后可获得足量破骨细胞。

3.2 各组破骨细胞凋亡率 温阳补肾方低、中、高剂量组在早期和晚期凋亡率与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。温阳补肾方高剂量组在早期和晚期凋亡率分别与低剂量组、中剂量组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；中剂量组与低剂量组在晚期凋亡百分率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2、表1。

3.3 Western Blot检测RANK蛋白的表达 温阳补肾方低、中、高剂量组RANK蛋白表达量与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；温阳补肾方高剂量组<中剂量组<低剂量组，差异有统计学意义（P < 0.05）；温阳补肾方中剂量组与低剂量组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3、表2。

4 讨 论

随着激素的广泛使用，激素已经远超过酒精成为股骨头坏死最主要的致病因素[5]。SANFH是由多因素综合作用而导致骨坏死和股骨头机械结构的破坏，而破骨细胞是唯一具有骨吸收功能的多核巨细胞。Rauner等[6]认为，超生理剂量的糖皮质激素可以刺激破骨细胞分化及增强其吸收活性，并可以抑制其凋亡，延长其生命周期，在SANFH的病程中发挥重要作用。另外，糖皮质激素还可以促进胶原纤维溶解，使吸收陷窝里矿物质的胶原纤维减少，从而影响破骨细胞脱落迁移到新的吸收点，使吸收陷窝变深、变宽，从而增强局部的骨吸收活性。Hong等[7]认为，糖皮质激素可抑制破骨细胞的凋亡，增强破骨细胞的活性。本实验从干预体外培养破骨细胞方面阐述温阳补肾方治疗SANFH机制。破骨细胞是高代谢的终末分化细胞，以往采用的长骨机械分离法获得破骨细胞，分离纯化较为困难，且不能增殖和传代，难以获取大量高纯度破骨细胞，故本实验选用诱导RAW264.7前体细胞向破骨细胞分化。结果显示，M-CSF 20 ng·mL-1+RANKL

40 ng·mL-1联合诱导可得到大量破骨细胞，TRAP染色呈阳性。

流式细胞仪检测凋亡的方法有多种，其中磷脂结合蛋白Annexin V-FITC/PI双标记染色最为常用。正常活细胞（图2左下象限）带负电的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）定位于细胞膜内侧，不能被AnnexinV-FITC或PI染色。细胞凋亡的早期，由于细胞膜失去对称性，PS从胞膜的内侧暴露于胞膜外，成为巨噬细胞清出凋亡细胞识别的标志。凋亡早期细胞（图2右下象限）仍保持膜的完整性，碘化丙啶（PI）不能进入细胞，而凋亡晚期和发生继发坏死的细胞（图2右上象限）可同时被Annexin V-FITC/PI着色，利用流式细胞仪进行双参数分析，能计算凋亡百分率[8]。结果显示，与空白对照组比较，温阳补肾方各剂量组含药血清干预破骨细胞48 h后，各组破骨细胞出现了凋亡，在双变量流式细胞仪的散点图上各组右上象限多于右下象限，说明细胞晚期凋亡多于早期凋亡，并且和温阳补肾方的剂量呈正相关性。而各组细胞除了凋亡外也有死亡，这可能是由于RAW264.7细胞经多次传代后，分化为破骨细胞的能力减弱[9]。

在破骨细胞分化、成熟过程中，OPG/RANKL/RANK系统发挥着极其重要的作用，RANK是一种肿瘤坏死受体蛋白，位于破骨前体细胞。RANKL与RANK结合，通过介c-Jun N-端激酶（JNK）、导激酶抑制子（IKK）、细胞外信号调节激酶（ERK）、p38和src途径，引起破骨细胞内一系列酶促级联反应，使破骨细胞前细胞分化、存活、融合为成熟破骨细胞，活化并抑制其凋亡[10]。OPG是RANKL的饵受体，它与RANK竞争性地结合RANKL，从而抑制破骨细胞分化成熟，并可诱导成熟破骨细胞的凋亡。

中医学理论认为，“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者肾之所主也；髓者，肾精所生，精足则髓足，髓足者则骨强”。肾中精气旺衰决定了骨骼的强弱，故应用补肾类中药可调控骨代谢。温阳补肾方（复方巴戟天合剂）是王和鸣教授经验方，方中以巴戟天温肾壮阳、强壮筋骨为君，骨碎补、淫羊藿、鹿角胶等温阳补肾药为臣，共奏温通血脉、补益肝肾、强筋壮骨之功效[11-12]。而在本研究前期动物实验中，笔者建立大鼠SANFH模型，对其股骨头骨陷窝率、成骨破骨细胞及胶原面积进行统计学分析，结果显示，中药治疗组表面有明显增多的骨祖细胞或成骨细胞，软骨细胞排列整齐，软骨下血管丰富。证明本方能激发成骨细胞活力，抑制破骨细胞功能，调节骨的代谢，促进新骨生长，保持骨小梁的完整结构，维持骨组织的力学框架，保护骨重建功能的顺利进行。魏迎辰[13]通过对建立兔SANFH模型，运用投射电镜观察模型组股骨头超微结构：软骨细胞多呈圆形状，数量少且分布稀疏，外形多皱缩，细胞核固缩呈椭圆状且染色质边聚，甚则核碎裂，产生凋亡小体。细胞质内许多空泡样脂滴形成，扩张的粗面内质网，多聚核糖体脱落，高尔基复合体较少。周围胶原纤维排列稀疏且结构紊乱。骨细胞核固缩，异染色质聚集甚至核碎裂，多被巨大脂滴压缩到一侧，细胞坏死凋亡形成空骨陷窝，周围的胶原纤维粗大且紊乱。而温阳补肾方中剂量组及温阳补肾方高剂量组，软骨细胞及骨细胞数量进一步增多，多数细胞器结构清晰且丰富，线粒体发达，多数无细胞核边聚碎裂，粗面内质网较多，周围胶原纤维分布排列致密且规则；并可以使SANFH兔血清OPG浓度上调及RANK和RANKL浓度下调，抑制破骨细胞的过度活化，恢复骨代谢动态平衡[1-2]。吴淮等[14]认为，健骨方防治股骨头坏死的机制可能通过调节OPG、RANKL水平来抑制破骨细胞活性、促进成骨形成。郑素玉等[15-17]研究发现，巴戟天含药血清可以明显抑制RANK、CAII、NFAT2 mRNA的表达，进而抑制破骨细胞的骨吸收功能及减少破骨细胞数量。刘梅洁[18]通过观察左归丸含药血清对破骨细胞分化调控因子OPG、RANKL的影响，推测中医“肾主骨”理论可能是通过对OPG、RANKL的调节而达到“主骨”的作用。本实验运用温阳补肾方含药血清干预破骨细胞48 h后，Western Blot法检测破骨细胞中RANK蛋白水平降低，打破RANKL与破骨细胞膜上特异性受体RANK的结合，从而抑制破骨细胞的分化成熟、减少破骨细胞数量，且温阳补肾方高剂量组含药血清效果最佳。

本研究结果提示，温阳补肾方能诱导破骨细胞凋亡，通过减少破骨细胞数量来保持股骨头机械结构可能是其治疗SANFH骨破坏作用机制之一。骨重建是维持骨组织代谢和力学功能的重要机制。破骨细胞进行骨吸收，而成骨细胞又不断在原位形成新骨。下一步可建立成骨细胞-破骨细胞共培养体系，观察本方对成骨细胞-破骨细胞偶联的影响，以揭示其治疗SANFH的机制。

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收稿日期：2015-01-04；修回日期：2015-03-09