陈齐勇 梁清 林煜 刘泊龄 李照辉

【摘 要】目的：研究体外雷奈酸锶对钛（Ti）颗粒刺激单核/巨噬细胞分泌溶骨因子及其膜上RANK表达的影响，探讨雷奈酸锶预防人工关节假体周围无菌性松动的可能性。方法：体外培养单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7，制备Ti颗粒，并采用MTT法检测绘制RAW264.7细胞增殖曲线，寻找雷奈酸锶最佳干预浓度。将RAW264.7分为3组：Ti微粒组（体积分数为0.1%的含Ti微粒+质量分数为10%的胎牛血清DMEM培养基）、Ti+雷奈酸锶组（体积分数为0.1%的含Ti微粒+最佳浓度雷奈酸锶+含质量分数为10%的胎牛血清DMEM培养基）和对照组（含质量分数为10%的胎牛血清DMEM常规培养基）。采用ELISA法检测各组培养液白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度。采用实时荧光定量SYBR GREEN法检测RANK mRNA表达。结果：Ti微粒组及Ti+雷奈酸锶组的细胞培养液中IL-1、TNF-α的含量及RAW264.7细胞RANK mRNA的表达量明显高于对照组（P < 0.05）。而Ti+雷奈酸锶组的IL-1、TNF-α的含量及RAW264.7细胞RANK mRNA的表达量明显低于Ti微粒组（P < 0.05）。

结论：Ti颗粒能刺激单核/巨噬细胞分泌IL-1、TNF-α，并能促进单核/巨噬细胞表达RANK。雷奈酸锶能明显抑制Ti颗粒诱导单核细胞分泌IL-1、TNF-α，以及抑制单核/巨噬细胞表达RANK。

【关键词】 雷奈酸锶；钛颗粒；单核细胞；骨溶解；溶骨因子；RANK

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.05.001

【ABSTRACT】Objective：To study the effects of strontium ranelate in vitro on titanium（Ti）particles stimulating mononuclear macrophage to secrete osteolysis factor and its RANK expression in order to probe the possibility of strontium ranelate to prevent periprosthetic aseptic loosening.Methods：Cultured in vitro mononuclear macrophage leukemia cells RAW264.7，prepared Ti particles，and detected and drew the cell proliferation curve of RAW264.7 with MTT method，to look for the best intervention concentration of strontium ranelate.RAW264.7 were divided into 3 groups：a Ti group（Ti particles with the volume ratio of 0.1% + 10% FBS DMEM），a Ti + strontium ranelate group（Ti particles with the volume ratio of 0.1% + strontium ranelate with best concentration + 10% FBS DMEM）and a control group（10% FBS DMEM）.The ELISA method was used to detect the concentration of interleukin-1（IL-1）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）in each culture solution.Detected the expression of RANK mRNA with the real-time fluorescence quantitative SYBR GREEN method.Results：The content of IL-1 and TNF-α and the expression of RANK mRNA of RAW264.7 cells in the cell culture fluid of the Ti group and the Ti + strontium ranelate group were significantly higher than those in the control group（P < 0.05）.While the content of IL-1 and TNF-α and the expression of RANK mRNA of RAW264.7 cells in the cell culture fluid of the Ti + strontium ranelate group were significantly lower than those in the Ti group，the difference between them being statistically significant （P <0.05）.Conclusion：Ti particles can stimulate mononuclear macrophage to secrete IL-1 and TNF-α and its RANK expression.Strontium ranelate can obviously inhibit Ti particles to secrete IL-1，TNF-α and the expression of RANK.

【Keywords】 strontium ranelate；titanium particles；mononuclear cells；osteolysis；osteolysis factor；RANK

人工关节置换术是治疗包括髋、膝关节等严重的关节终末期疾病的重要手段，而人工假体周围骨溶解引起的假体无菌性松动仍然是影响人工关节置换术远期疗效的主要原因[1]。目前认为，假体使用中产生的磨屑颗粒与假体周围的组织、细胞相互作用，引发一系列生物反应，单核/巨噬细胞分泌炎症因子，活化破骨细胞导致骨溶解，引起假体松动[2-5]。单核/巨噬细胞膜上的核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor kappa B，RANK）具有调节破骨细胞的分化、成熟和功能等重要作用[6-7]。雷奈酸锶已被证实能抑制破骨细胞活跃导致的骨吸收[8]，故可能可以抑制钛（Ti）颗粒引发的骨溶解。本文拟通过体外实验研究雷奈酸锶对Ti颗粒诱导单核细胞分泌炎症因子及RANK表达的影响。

1 实验材料

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心），雷奈酸锶（Servier公司），Ti微粒[北京有色金属公司，平均直径（0.91±0.65） μm]，白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（上海西唐公司）。

2 方 法

2.1 Ti微粒的制备与处理 Ti颗粒300 ℃高温烘培6 h，取每100 mg Ti颗粒悬浮于25 mL质量分数为75%的乙醇中，水平摇床200 r·min-1振荡24 h，离心后更换质量分数为75%的乙醇继续振荡24 h，PBS洗涤3次，紫外线下干燥后备用，内毒素检测试剂盒检测显示颗粒黏附内毒素浓度< 0.10 EU·mL-1，可排除内毒素对细胞的影响。用质量分数为25%的硝酸和0.1 N的氢氧化钠反复清洗后，将Ti微粒置于磷酸缓冲液（DPBS）中配制成体积分数为0.1%的混悬液并经高温消毒备用。体积分数每毫升0.1%的Ti微粒混悬液约含4.5×107微粒，实验加样前用超声磁力震荡器震荡10 min，消除微粒粘连。

2.2 雷奈酸锶对RAW264.7细胞增殖的影响 取RAW264.7以104·mL-1接种于96孔板中，培养过夜后，弃去旧培养液，分别加入含0，0.078，0.156，0.3125，0.625，1.25，2.5，5，10 mg·mL-1的培养基，每个浓度设8孔，培养72 h，每孔加入20 μL四唑盐液（5 g·L-1），37 ℃孵育4 h后吸去上清液，加入DMSO液体每孔150 μL，在摇床上振荡10 min，用酶标仪选择490 nm波长测定各孔吸光度值（A），其值与细胞数量成正比。比较不同浓度雷奈酸锶对RAW264.7增殖的影响，并找出最佳的干预RAW264.7的药物浓度。

2.3 雷奈酸锶干预 将单核/巨噬细胞以1×106个/

孔密度接种于6孔板，将其放入孵箱过夜。在加入金属离子前，酞酚蓝检测6孔板中单核/巨噬细胞活性 > 98%。分为3组：Ti微粒组（体积分数为0.1%的含Ti微粒+质量分数为10%的胎牛血清DMEM培养基）、Ti+雷奈酸锶组（体积分数为0.1%的含Ti微粒+最佳浓度雷奈酸锶+含质量分数10%胎牛血清DMEM培养基）和对照组（含质量分数为10%的胎牛血清DMEM常规培养基）。3组均连续培养48 h。

2.4 ELISA法检测培养液IL-1、TNF-α浓度 干预培养48 h取培养液。每孔分别加入样品、样品稀释液、标准品各100 μL，37 ℃温育30 min后，先后加入酶标偶合液、底物、终止液50 μL，于450 nm波长读取OD值。样品、标准品均设复孔，每个样本重复一次。

2.5 实时荧光定量SYBR GREEN法检测RANK mRNA表达 培养48 h，采用Trizol法提取总RNA，抽提后的RNA加入溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果通过凝胶图像分析系统对条带进行分析；检验RNA无降解，测定RNA的吸光度值，计算出RNA的浓度，再根据浓度计算出体积后取RNA 500 ng按试剂盒步骤进行反转录。反转录后在ABI7500上按照试剂说明进行mRNA扩增，得到扩增曲线与CT值。设复孔取均值，每个样本每个指标重复3次。使用7500 system SDS软件计算数据，进行组间相对量的比较。所用引物序列见表1。

2.6 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以表示，多组之间比较先采用F检验，而后进行q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 不同浓度雷奈酸锶组促RAW264.7细胞增殖情况 通过MTT法检测绘制RAW264.7细胞增殖曲线图发现，随着雷奈酸锶的浓度增加，细胞增殖速度逐渐上升，当浓度达到1.25 mg·mL-1时达到顶峰，之后细胞增殖明显降低。因此确定

1.25 mg·mL-1雷奈酸锶为干预最佳浓度。见图1。

3.2 各组培养液中IL-1、TNF-α表达结果 Ti微粒组培养液中IL-1、TNF-α的表达明显高于Ti+雷奈酸锶组，而以上两组细胞液中的IL-1、TNF-α含量均高于对照组，各组间比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3.3 干预48 h后各组RAW264.7细胞RANK mRNA

基因表达结果 荧光定量PCR结果表明，Ti微粒组及Ti+雷奈酸锶组的RANK的RNA表达均高于未含Ti颗粒的对照组，且Ti微粒组的RANK表达高于Ti+雷奈酸锶组，各组间比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。该实验按照同样方法重复4次，采用完全随机设计的方差分析比较Ti微粒组及Ti+雷奈酸锶组各个时间点的统计数据。见表3、图2、图3。

4 讨 论

人工关节置换术已普遍运用于临床，但假体松动的问题始终存在。目前认为，假体在使用过程中的相对运动、老化、电解等产生磨屑颗粒，这些颗粒作为异物被单核/巨噬细胞吞噬后，诱发后者产生炎症反应，释放一系列炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1、M-CSF、PGEZ）；这些因子再通过一系列生物学反应活化破骨细胞，释放泌酸性磷酸酶、金属蛋白酶等，引发骨溶解[9]。另有文献表明，在一定条件下，单核细胞可以向破骨细胞转化，引起骨吸收[10]。在破骨细胞的前体细胞表面存在RANK，它与相应配体（RANKL）结合能引发破骨细胞分化、成熟，RANK的表达是调节破骨细胞活化的重要环节[11]。TNF能直接使野生型破骨细胞前体表达RANK，激活核转录因子-κB（NF-κB）、c-Fos和NFATc1，并使其向破骨细胞分化，而IL-1可直接诱导破骨细胞形成[12]。TNF还能在rankl-/-和rank-/-小鼠体内间接通过自身或其他因子诱导成骨细胞生成RANKL来促进形成破骨细胞，提示TNF能通过非RANK途径促进破骨细胞形成[13]。因此抑制单核/巨噬细胞分泌TNF、IL-1并抑制其表达RANK，对抑制破骨细胞形成与活化具有重要意义。已有一些研究提示，二磷酸盐、辛伐他汀等能抑制单核细胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1等，能在某种程度上使破骨细胞活化受到抑制[14-16]。本实验结果显示，与对照组比较，Ti微粒组的培养液中IL-1、TNF-α明显增多，说明Ti颗粒能诱导单核细胞/巨噬细胞分泌溶骨因子。而与对照组比较，Ti微粒组RANK表达增加，说明Ti颗粒能促进破骨细胞前体分化。与Ti微粒组比较，Ti+雷奈酸锶组的单核细胞/巨噬细胞RANK mRNA的表达明显减少（P < 0.05），其培养液中IL-1、TNF-α也明显减少（P < 0.05），说明雷奈酸锶可以明显抑制Ti颗粒诱导单核细胞分泌的IL-1和TNF-α，以及抑制其表达RANK。

综上所述，雷奈酸锶可以减少Ti颗粒诱导的单核细胞/巨噬细胞分泌IL-1和TNF-α，且能明显减少其表达RANK mRNA，抑制破骨细胞前体的分化潜能，从而可能延缓骨溶解；因而，可以认为，雷奈酸锶可能有预防假体周围骨溶解的作用，有望成为防治假体周围骨溶解的新选择。本实验属体外研究，只研究了单核/巨噬细胞的部分生物学行为。雷奈酸锶在体内是否能预防或延缓假体松动，以及雷奈酸锶具体通过什么机制影响单核细胞/巨噬细胞这些行为，都尚需进一步研究。

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收稿日期：2015-01-06；修回日期：2015-02-17