岳黎敏，程书珍，郑海萍，商小涓

（河北工程大学：1.医学院基础医学系；2.医学院检验系；3.附属医院中心实验室，河北邯郸056029）

食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是一种高侵袭性的恶性肿瘤，5年生存率仅为10.00%～13.00%，高侵袭转移能力是ESCC预后差的主要原因。细胞分化/DNA 结合抑制因子2（inhibitor of differentiation/DNA binding 2，Id2）属于螺旋－环－螺旋（HLH）家族中分化抑制因子Id蛋白家族的成员。近年研究表明Id2分子在多种肿瘤高表达，并可促进肿瘤的生长及侵袭转移［1－2］。基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）作为 MMPs家族的重要成员，在多种肿瘤的侵袭、转移中起重要作用［3－5］。但ESCC中Id2的表达及其与MMP9表达的关系，国内外少有报道。本文通过检测ESCC中Id2和MMP9的表达情况，以期探讨Id2在ESCC发生、浸润进展中的作用，以及Id2与MMP9表达的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2011～2014年河北工程大学附属医院就诊的食管癌高发地区（河北邯郸市及周围地区）ESCC术后标本70例，另随机选取30例手术切除的食管癌切除段的两端切缘处组织（＞5cm）为对照，经组织学确认为正常食管上皮。病例纳入标准：（1）经病理医师确诊为ESCC；（2）术前未接受放射治疗或化学治疗；（3）病史及临床病理资料完整。排除标准：（1）病理学诊断不属于ESCC；（2）术前曾接受放射治疗或化学治疗；（3）临床病理资料不完整。

1.2 方法 兔抗人Id2单克隆抗体为Bioworld公司产品，鼠抗人MMP9单抗、SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥公司。免疫组织化学采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶法（streptavidin peroxidase，SP），按试剂盒说明书操作，微波抗原修复，用已知的乳腺癌阳性切片做阳性对照，以PBS代替一抗做阴性对照。

1.3 结果判定 Id2结果判定根据染色强度和阳性细胞百分比进行综合计分。染色强度：无着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；阳性细胞的百分比：在光学显微镜下随机选取5个高倍视野（×400），计数阳性细胞的百分比的平均数，阴性为0分，阳性细胞：≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%计4分；染色程度×阳性细胞百分比得0分为阴性（－），1～4分为低表达（＋），＞4分为高表达（＋＋）。MMP9结果判定，阳性细胞：＜10%为（－），10%～50%为（＋），＞50%为（＋＋）；计数均由2位资深病理医师采用双盲法观察计算获得。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计学软件进行数据处理，采用χ2检验、等级资料秩和检验（Mann－Whitney U 法和Kruskal－Wallis H 法）及Spearman等级相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Id2和MMP9在正常食管上皮和ESCC组织中的表达Id2与MMP9均主要定位表达于ESCC细胞的细胞质（图1、2），在 ESCC 中两者表达阳性率分别为92.85%（65/70）和84.29%（59/70），均显著高于在正常食管上皮中阳性率16.67%（5/30）和20.00%（6/30），差异有统计学意义（均P＜0.001）。

2.2 Id2、MMP9表达与ESCC临床病理参数的关系 Id2和MMP9的表达均与ESCC的浸润深度、临床TNM分期显著相关，两种因子的表达水平均随浸润加深、TNM分期级别增高而升高，浸润深度在T3＋T4组（浸及纤维膜）的表达水平高于T1＋T2组（未浸及纤维膜），临床Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期的表达水平高于Ⅰ期，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Id2和 MMP9的表达均与分化程度无相关（P＞0.05）。淋巴结转移组中 MMP9的表达水平高于无淋巴结转移组（P＜0.05）；而Id2的表达与淋巴结转移无相关（P＞0.05），见表1。

图1 Id2在ESCC和正常食管上皮的表达（SP染色×400）

图2 MMP9在ESCC和正常食管上皮的表达（SP染色×400）

表1 Id2、MMP9表达与ESCC临床病理参数的关系（n）

表2 Id2与MMP9在ESCC中表达的相关性

2.3 Id2与MMP9表达的相关性 经Spearman等级相关分析显示，ESCC中Id2和 MMP9的表达水平呈正相关（rs＝0.272，P＝0.023），见表2。

3 讨 论

Id蛋白为碱性DNA结合区缺失的HLH蛋白，作为转录调控因子，他主要通过与众多的bHLH类转录因子（约200多个）形成无活性的异二聚体，抑制bHLH的功能，从而抑制细胞的分化，促进细胞的增殖。已有研究表明Id分子作为转录调控因子参与调控细胞周期、细胞分化以及肿瘤的发生、转移等过程［1，6］。目前在哺乳动物已发现的Id蛋白有4种：Id1、Id2、Id1和Id4。其中Id1在多种肿瘤中的诊断和治疗价值已得到广泛关注。近年研究表明Id2与多种肿瘤的发生也关系密切。本研究结果显示Id2在ESCC中的阳性表达率显著高于正常食管上皮，与多数文献报道一致［6－8］，提示Id2可能是食管鳞癌的发生中一个重要的分子生物学标志。

有关Id2与肿瘤临床病理特征关系的研究发现，Id2的功能存在明显的组织特异性，在不同类型的肿瘤中其功能和意义也不同，如在前列腺癌、卵巢癌中Id2表达水平与肿瘤的分化程度、浸润深度呈正相关，与其预后呈负相关［7］；而在乳腺癌，Id2表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移呈负相关，是其预后的良性指标［2，8］。此外，在体外培养的细胞株研究中发现，Id2蛋白可使多种肿瘤细胞的侵袭性增强，如在乳腺癌细胞株MCF－7［9］、卵巢癌细胞株 SKOV3［9］及前列腺癌细胞株［7］转染结构性表达的Id2，均可引起癌细胞侵袭能力明显增强。本研究结果显示在体内ESCC组织中Id2的表达随肿瘤的浸润加深、TNM分期级别增高而升高，提示Id2过表达使ESCC细胞的侵袭能力增强，促进ESCC浸润进展，可能是判断其生物学行为和预后的恶性指标。但本研究也显示Id2的表达水平与ESCC的分化程度及淋巴结转移未见显著相关性，结果与Yuen等［6］一致。

MMP9属于明胶酶类，又称为明胶酶B。已从基因水平证实MMP9由癌细胞产生，MMP9可降解基膜和细胞外基质，促使癌细胞穿越组织屏障，向肿瘤的周围或远处侵袭转移［3］。MMP9在多种肿瘤中表达升高，本研究证实MMP9在ESCC中阳性表达率显著高于正常食管上皮，并且MMP9表达水平与ESCC的浸润深度、临床分期及淋巴结转移存在相关性，说明MMP9的过表达在ESCC的侵袭和转移中也具有重要作用，与以往的报道结果一致［10］。目前关于Id分子与MMP表达关系的研究中发现，将Id1转染前列腺癌细胞株CNCaP，可使活化型MMP2分泌量显著升高［7］；采用SiRNA技术在高侵袭性前列腺癌细胞株PC3和DU145中沉默Id1、Id2、Id3基因表达，均可引起MMP9基因的表达下降，其作用机制已证实依赖于Id分子的HLH结构域［11］。另 Wang等［12］证实Id2的靶基因NF－κB可调控 MMP9的表达，在ESCC细胞株EC9706中转染结构性表达的NF－κB，可致 MMP9表达升高。本研究显示在体内ESCC组织中Id2与MMP9均高表达并呈正相关关系，提示Id2可能通过HLH结构域或转录因子NF－κB等途径促进MMP9的表达，Id2可直接或间接提高癌细胞的侵袭能力，两种因子可能协同促进了ESCC的浸润进展。

综上所述，Id2与MMP9在ESCC的发生及浸润进展中可能起着协同促进作用，联合检测Id2与MMP9的表达，有望成为评估其生物学行为和预后的重要生物学指标。但在体内ESCC中，Id2能否促进转移及Id2与MMP9协同作用的分子机制等问题，还有待于通过预后随访、大宗样本及基因水平等深入研究。

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