唐政恒，高诗豪，陈图南，李 飞，陈冬艺，单佑安，冯 华，程 远

（重庆医科大学附属第二医院神经外科 400038）

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是多病因致脑底或脑及脊髓表面血管破裂的急性出血性脑血管病，约占急性脑卒中的10.0%，占出血性脑卒中的20.0%。SAH常采取控制血压、减轻水肿及止血予以治疗，目前多选用以尼莫地平为代表的钙拮抗剂进行治疗，尼莫地平脂溶性强，能透过血－脑屏障，有效改善血肿周围脑血流量并减轻脑水肿，进而减轻对周围脑组织的压迫，减少神经细胞的损害［1－2］。近年研究显示，补体系统过度活化在SAH发病过程中也发挥了重要作用，但目前临床上尚缺乏有效的补体抑制性药物。

草麻黄在我国分布广，是中药方剂的常用药［3］，对急性肾炎、支气管哮喘、免疫炎性反应相关疾病等有较显著的疗效，有研究认为，抑制补体活化介导的炎性及免疫反应是草麻黄发挥治疗作用的根本机制［4］。补体激活成分C3a是一种重要的炎性介质，在感染、创伤、缺血再灌注损伤、自身免疫疾病等多种原因引起的急、慢性炎性反应中，介导了对自身组织细胞的病理性损伤。而炎性及免疫反应，尤其补体活化介导的炎性及免疫反应在中枢神经系统损伤中的预后起重要的作用［5］。因此，用补体抑制剂阻断补体活化可成为治疗炎症的一种有效手段，杨康等［6］证实草麻黄水提物中碱沉淀物在体外具有良好的补体抑制活性。故本研究采用草麻黄水提物灌胃SAH大鼠，观察其对SAH的治疗效果，为SAH治疗提供新方法。

1 材料与方法

1.1 草麻黄水提物的制备 草麻黄水提物制备主要参考Ling等［7］的方法进行。具体方法：1kg草麻黄加入10L蒸馏水（pH 4.0），60℃过夜后煮沸1h，过滤除渣，NaOH 调其pH值至9.0并出现大量沉淀，离心弃上清液，无水乙醇洗涤沉淀3次，60℃烘干得棕褐色粗品18.500g。将粗品溶于300mL蒸馏水（pH 4.0），磁力搅拌1h，离心弃沉淀，再用 NaOH 调其pH值至9.0，离心弃上清液。上述酸溶碱沉过程重复3次，最后得水提物2.375g，得率为12.8%（粗品计算），使用前将碱沉淀物溶于蒸馏水中，调pH值至4.0。

1.2 动物分组与SAH模型制备 SPF级SD大鼠50只，体质量200.00～250.00g，2～3个月龄，第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供，雌雄各半，随机数字表法随机分为模型组、对照组和3个不同浓度（4、12、36mg/kg的草麻黄水提物）治疗组，每组10只。以一尼龙线（Φ0.235mm）自颈外动脉导入，经颈总动脉达颈内动脉颅内段穿刺其分叉处，以此建立SAH模型。手术显微镜下，将一尼龙线（Φ0.235 mm）自颈外动脉导入，经颈总动脉达颈内动脉颅内段穿刺其分叉处，以此建立大鼠SAH模型［8］，并可通过局部脑血流量监测判断模型是否成功［9］。建模12h后，治疗组以4、12、36 mg/kg的草麻黄水提物分别灌胃，对照组仅剥离各动脉管作假手术对照，对照组及模型组仅以等量生理盐水灌胃治疗。随时观察各组动物的活动、进食、大小便等状况。

1.3 检测指标 3d后断头处死各组实验大鼠，解剖大鼠脑组织，大体观察其损伤、出血等情况。采用干湿法检测脑组织含水量，并制作10.0%组织匀浆，离心取上清液进行谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）、丙二醛（MDA）、羟自由基等检测，严格按试剂盒操作说明书进行。HE染色：取海马组织，制成常规病理石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察各组病变情况。免疫组织化学观察：用抗补体C3鼠抗人单克隆抗体（Santa Cruze，sc－28294，1∶200）配合即用型检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，SP－9002）对补体C3抗原染色，DAB显色并拍照。提取总蛋白：取大鼠海马组织，剪碎后加RIPA裂解液（碧云天，P0013B）。冰浴中匀浆，离心取上清液，测蛋白浓度后分装，置－80℃保存备用。蛋白水平测定按BSA法，以牛血清清蛋白为标准蛋白。Western blot检测：50μg/孔蛋白样品经6.0%十二烷基硫酸钠－聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离后，13V（恒压）过夜，将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上。PVDF膜以含5.0%脱脂奶粉的TBST（100 mmol Tris，0.9%NaCl，pH 7.5）室温封闭2h，抗补体C3鼠抗人单克隆抗体（Santa Cruze，sc－28294，1∶200）室温反应2h，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（1∶1 000倍稀释）室温反应2h。化学发光法显色并拍照。

1.4 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 术后大鼠一般情况和大体观察 术后正常饲养，除对照组外，其余各组大鼠均出现进食减少，精神萎靡，活动缓慢及个别鼠大小便失禁等。术后3d内，除36mg/kg治疗组与对照组大鼠无死亡外，其余各组均死亡1只。除对照组外，其余各组均见明显SAH，大量弥散性出血及血凝块，主要分布于前、后颅窝处，包绕脑底部血管，穿刺侧出血量相对较多。

2.2 脑组织含水量 脑组织观察可见SAH损伤脑组织较对照组明显水肿，体积增大，模型组脑含水量显著高于对照组（P＜0.01）；草麻黄水提物12mg/kg及36mg/kg治疗组脑组织含水量较模型组有明显降低（P＜0.05），4mg/kg治疗组与模型组差异无统计学意义（P＞0.05），且脑含水量随着用药剂量增加呈下降趋势。见表1。

图1 草麻黄水提物治疗SAH的病理观察（×100）

2.3 生化指标检测 SAH后3d，各组实验大鼠脑组织匀浆生化指标检测结果显示，与模型组比较，对照组显著降低（P＜0.01），草麻黄水提物12、36mg/kg治疗组 MDA水平、GSHPx酶活力与羟自由基能力显著降低（P＜0.01）；草麻黄水提物4mg/kg治疗组的MDA水平变化不明显，GSH－Px酶活力与抑制羟自由基能力显著降低（P＜0.05），见表2。

2.4 HE染色观察病理情况 术后3dHE染色显示，模型组脑组织海马CA1区呈现明显充血、水肿，部分细胞肿胀、皱缩，细胞周间隙增大。对照组海马CA1区神经元排列整齐，结构完整，核仁及尼氏体清楚。而草麻黄水提物治疗后，充血与水肿均有不同程度的缓解（图1），且随药物剂量的增加其充血、水肿改善越明显。

2.5 免疫组织化学检测补体C3表达情况 免疫组织化学结果表明，各组大鼠脑组织海马CA1区均见补体C3表达，其中对照组表达很弱，SAH模型组的表达最强，草麻黄水提物治疗组C3表达较模型组均有降低，提示草麻黄水提物对补体活化具明显抑制作用。见图2。

图2 免疫组织化学检测草麻黄水提物治疗SAH后补体C3表达情况（×100）

表1 各组大鼠脑组织含水量的比较（±s）

表1 各组大鼠脑组织含水量的比较（±s）

a：P＞0.05，b：P＞0.01，与模型组比较。

组别 n 脑组织含水量（%）对照组 5 76.58±0.72a模型组 5 83.25±0.34 4mg/kg治疗组 5 82.76±1.02 12mg/kg治疗组 5 80.01±1.25b 36mg/kg治疗组 5 79.64±2.07b

表2 各组大鼠脑组织生化指标检测（±s）

表2 各组大鼠脑组织生化指标检测（±s）

a：P＜0.01，b：P＜0.05，与模型组比较。

组别 n MDA（mmol/L）GSH－Px（U/mL）羟自由基能力（U/mL）对照组 5 5.44±1.95a194.52±2.76a10.82±4.25a模型组 5 32.30±1.72 559.74±7.39 83.02±1.09 4mg/kg治疗组 5 28.10±9.94 408.46±6.22b 48.54±2.31b 12mg/kg治疗组 5 15.71±5.81a398.78±11.20a21.35±11.49a 36mg/kg治疗组 5 11.10±3.09a297.01±1.65a20.25±10.82a

2.6 Western blot法检测补体C3表达情况 术后3dWestern blot检测结果表明，各组大鼠脑组织海马CA1区均有补体C3表达，其中对照组表达最弱，模型组表达最强，治疗组居中，且36mg/kg治疗组与模型组相比明显降低，4mg/kg与12 mg/kg治疗组与模型组相比变化不明显，进一步证实了草麻黄水提物对补体活化具有明显抑制作用。见图3。

图3 Western blot检测草麻黄水提物治疗SAH后补体C3表达情况

3 讨 论

Ling等［7］从草麻黄中纯化出一种单体成分（CIC），并初步鉴定为高分子碳水化合物，不溶于碱溶于酸，证实该成分在体外具有良好的补体抑制活性。Ling等［7］在体外实验中提出，CIC通过结合补体蛋白C2的活性部位，从而抑制补体激活的经典途径，且该结合是不可逆的；其次，CIC抑制补体蛋白C9的活化，并抑制终末途径激活补体；但对替代途径激活补体的抑制机制尚不清楚，很有可能是通过抑制B因子的活性发挥作用。

中枢神经系统损伤是存在补体系统激活的必要条件。中枢神经系统损伤患者脑组织存在自由基代谢紊乱，细胞膜磷脂中多聚不饱和脂肪酸的不饱和双键受自由基的攻击，导致脂质过氧化反应，形成一系列的脂质自由基及其降解产物如MDA等。因此，大量氧自由基的产生及其诱导的脂质过氧化在中枢神经系统损伤的发病机制中起着重要作用［8－10］。GSH作为一种体内自由基清除剂与GSH－Px结合，参与自由基和脂质过氧化物损伤的防护，在脑损伤抗氧化防御中发挥作用［11－12］。本研究生化指标检测结果说明，经草麻黄水提物治疗后，与模型组相比，治疗组脑组织中MDA、GSH－Px与羟自由基水平均显著降低。提示草麻黄水提物在SAH的抗脂质过氧化损伤中可能起重要作用。

补体系统的重要固有成分C3，是补体活化后的主要片段，处于3个途径的汇合点，在补体系统激活过程中起着枢纽作用［13］。本研究将草麻黄水提物用于治疗大鼠SAH，免疫组织化学与Western blot结果显示，在对照组、草麻黄水提物治疗组及模型组的脑组织中均有重要补体固有成分C3的表达，但对照组中表达很弱，且草麻黄水提物治疗组的C3表达明显低于模型组，提示草麻黄水提物可能抑制补体系统的激活。常规病理观察及脑组织含水量显示，草麻黄水提物治疗后，SAH与水肿均得到不同程度的缓解，且从切片上可以观察到出血与水肿随剂量的增加改善越明显。

综上所述，草麻黄水提物能显著抑制补体C3活性，阻止脑组织MDA、GSH－Px、羟自由基的产生，降低脑水肿的严重程度，从而减轻炎性反应，对SAH动物具有较好的治疗效应。

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