曾跃红等

[摘要] 目的 探讨乙型病毒性肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群、血清干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的变化与疾病临床转归的关系。 方法 收集2009年1～12月益阳市中心医院诊治的352例乙肝病毒性肝炎患者，并选择同期健康人82例作为对照。采用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+），ELISA法检测细胞外血清IFN-γ和TNF-α，比较乙肝病毒性肝炎患者与健康人外周血T淋巴细胞亚群及IFN-γ和TNF-α水平。 结果 不同HBV-DNA载量的患者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-γ和TNF-α水平与健康人比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。急性或亚急性肝衰竭、慢性HBV感染、隐匿性HBV感染患者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-γ和TNF-α水平与健康人比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。212例HBc-IgM阳性HBV患者经保肝护肝基础治疗（106例）和IFN-α治疗（106例）6个月后，患者的CD3+、CD4+、IFN-γ和TNF-α水平仍较健康人显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05），但CD4+/CD8+的比较差异无统计学意义（P > 0.05）。IFN-α治疗患者治疗6个月和随访1、3、5年时，HBV-DNA阴转率均高于保肝护肝基础治疗患者（P < 0.05）。 结论 乙型病毒性肝炎患者存在细胞免疫功能紊乱，其功能状态直接影响临床转归，动态监测患者T淋巴细胞亚群和血清IFN-γ、TNF-α对乙型病毒性肝炎的诊断、治疗、预后评估及个体化治疗都有重要的意义。

[关键词] 乙型肝炎病毒；细胞免疫功能；转归

[中图分类号] R512.62 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）02（b）-0008-05

[Abstract] Objective To explore the correlation between the change of T cell subgroups， serum IFN-γ， TNF-α in patients with hepatitis B and clinical prognosis. Methods From January to December 2009， in the Center Hospital of Yiyang City， 352 patients with hepatitis B were selected， and 82 healthy people were selected as control at the same time. Flow cytometer was used to detect the T cell subgroups （CD3+， CD4+， CD8+）， and the level of serum IFN-γ and TNF-α were detected by ELISA， the results were compared. Results The levels of CD3+， CD4+， CD8+， CD4+/CD8+， IFN-γ and TNF-α in different HBV-DNA capacity patients were compared with those in healthy people， the differences were statistically significant （P < 0.05） The levels of CD3+， CD4+， CD8+，CD4+/CD8+， IFN-γ and TNF-α in acute or subacute liver failure， chronic HBV infection， delitescence HBV infection patients were compared with those in healthy people， the differences were statistically significant （P < 0.05）. 212 patients with HBc-IgM positive HBV were given liver protection basic treatment （106 cases） and IFN-α treatment （106 cases） for 6 months， the CD3+，CD4+，IFN-γ and TNF-α levels were significantly higher than those in healthy people， the differences were statistically significant （P < 0.05）， but the difference of CD4+/CD8+ was not statistically significant （P > 0.05）. HBV-DNA negative rates of patients given IFN-α treatment at 6 months finished， follow-up 1， 3， 5 years were higher than those patients given liver protection basic treatment （P < 0.05）. Conclusion The disorder of cellular immunity in patients with hepatitis B was confirmative. The functional status may to directly affect the hepatitis B prognosis. Dynamic monitoring of the T cell subgroups and serum IFN-γ， TNF-α on hepatitis B patients， which has important clinical significance to diagnosis， treatment， prognosis and individual therapy.

[Key words] HBV； Cellular immune function； Prognosis

乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝DNA病毒，人体感染后引起急性、慢性乙型肝炎或成为无症状病毒携带者，迁延难愈，可发展成为肝硬化、肝癌等[1]，但目前对其发病机制尚未彻底清楚，多数学者认为与免疫应答或免疫调节功能紊乱有关。成人、儿童及幼儿感染HBV后，分别有5%、30%和95%成为慢性HBV感染者，这表明机体免疫成熟程度是决定HBV持续感染的重要因素[2]。因此深入研究其发病机制和感染慢性化的原因，了解不同类型HBV感染者免疫应答的特点与宿主免疫功能之间的关系，探讨机体自身细胞免疫功能在乙型病毒性肝炎转归中的作用是当前亟需解决的课题。

1 资料与方法

1.1 一般资料

对2009年1～12月益阳市中心医院（以下简称“我院”）诊治的HBV感染者进行回顾性流行病学调查后获得869例血清标本。经乙肝两对半及荧光定量PCR检测HBV-DNA检查，并排除合并其他病毒感染发现，现行HBV感染者352例，其中HBV-DNA阳性209例，HBV-DNA阴性143例；男196例，女156例；年龄1～46岁，平均（29.65±15.28）岁；按不同转归[3-4]分：急性或亚急性肝衰竭者96例，急性自限性HBV感染者86例，慢性HBV感染者90例，隐匿性HBV感染者80例。再选择同期来我院健康体检者82例作为对照，均无心、肝、肺、肾等重要脏器疾病，经临床检查排除炎症、免疫性疾病和肿瘤，HBV标记测定阴性且肝肾功能正常。其中男42例，女40例；年龄2～50岁，平均（31.17±13.46）岁。两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（t=1.935，P > 0.05）。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

1.2.1.1 血清病毒学标志物检测 乙肝五项指标检测采用ELISA法，试剂由上海科华生物公司生产，操作过程按说明书进行。

1.2.1.2 血清HBV-DNA检测 HBV-DNA检测采用荧光定量PCR法，HBV-DNA>1.0×103 copies/mL判定为阳性，试剂由上海万兴生物公司生产，操作过程按说明书进行。

1.2.1.3 流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群 采用Beckman-Coulter公司的EPICS -XL型流式细胞仪进行荧光标记抗体检测。检测淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+）所用的单克隆抗体及其组合为：TC-CD3/FITC-CD4/PE-CD8：同型阴性对照分别为Tc-IgG2a/PE-IgG2a/FITC-IgG2a；上述试剂均购自CALTAG公司，操作过程按说明书进行。

1.2.1.4 血清细胞因子检测 采用ELISA法检测细胞外血清细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），试剂盒购自DIACLONE公司，具体步骤按说明书严格操作。

1.2.2 治疗方法

HBc-IgM阳性患者依患者经济状况及自愿，采用保肝护肝基础治疗，干扰素-α（IFN-α）治疗。治疗满6个月后检测患者细胞免疫功能指标。

1.2.2.1 IFN-α治疗 IFN-α 5×106 U，皮下注射，每日1次，2周后改为每周3次。

1.2.2.2 保肝护肝基础治疗 采用降酶、保肝治疗。

治疗满3个月者作为观察统计对象。治疗6个月后HBV-DNA阴转或下降>1.00×105 coples/mL者进入继续治疗组，再治疗6个月，治疗后随访1、3、5年再观察HBV-DNA阴转率。最后IFN-α治疗106例，保肝护肝基础治疗106例，共212例。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同HBV-DNA载量患者与健康人细胞免疫状态的比较

HBV-DNA阳性、HBV阴性患者的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平下降，CD8+、IFN-γ和TNF-α水平显著性上升，与健康人比较差异有统计学意义（P < 0.05）；同时HBV阴性较HBV-DNA阳性患者的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平增高，CD8+、IFN-γ和TNF-α水平显著性下降，差异均有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 急性或亚急性肝衰竭、急性自限性HBV感染、慢性HBV感染、隐匿性HBV感染与健康人的细胞免疫水平以及细胞因子水平的比较

急性或亚急性肝衰竭、慢性HBV感染、隐匿性HBV感染患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-γ和TNF-α水平与健康人比较，差异均有统计学意（P < 0.05）。急性自限性HBV感染者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与健康人比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。HBV感染各类型患者的IFN-γ和TNF-α水平较健康人均显著升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。不同HBV感染类型患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、INF-α和TNF-α水平的比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。

2.3 212例HBc-IgM阳性患者行保肝护肝基础治疗、IFN-α治疗6个月后与健康人的细胞自身免疫状态的比较

治疗6个月后，患者的CD3+、CD4+、CD8+、IFN-γ和TNF-α水平仍较健康人显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05），但CD4+/CD8+的比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。且两种治疗方案患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-α和TNF-α比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.4 212例HBc-IgM阳性患者治疗6个月及随访1、3、5年时HBV-DNA转阴情况

治疗6个月及随访1、3、5年时，IFN-α治疗的患者HBV-DNA阴转率高于保肝护肝基础治疗的患者，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

目前一致认为，HBV感染的发病涉及病毒和机体两个方面的原因，机体清除HBV而引发细胞免疫病理改变，T细胞是清除HBV和引起机体损伤的重要效应细胞。成人感染HBV后，绝大多数能产生活跃的抗病毒细胞免疫反应，完全消除病毒；新生儿获得性感染则绝大多数由于对HBV免疫耐受、免疫功能不全等形成慢性感染。人体初次感染HBV以后，主要表现为4种临床转归[3-4]：①急性自限性肝炎；②急性或亚急性肝衰竭；③隐匿性肝炎；④慢性乙型肝炎。HBV急性感染以后，如果机体的细胞免疫和体液免疫应答能很好地清除病毒，急性自限性肝炎是理想的临床转归[4]。研究表明，抗病毒免疫应答功能缺陷是慢性乙型肝炎最重要的特征之一，具体表现为：①固有免疫的损伤；②特异性免疫的损伤；③增强的肝脏免疫耐受。进一步研究证实，HBV感染后，疾病的临床转归与个体的免疫应答强度、宽度和持续的时间密切关联。因此，在影响乙型肝炎疗效的诸多因素中，人体的免疫状态以及其抗病毒免疫应答在很大程度上决定了HBV感染的临床转归和进展[4-5]。

就宿主而言，机体的免疫状态、尤其是感染初期的免疫状态是决定疾病发展的关键因素[6]。机体维持正常的免疫功能状态，有赖于各种免疫细胞（特别是各类T细胞亚群）之间的相互协作/制约，以产生适度的免疫应答，使之既能清除异物抗原，又不致损伤机体自身组织[7]。正常情况下，这些细胞及其亚群的数目在周围组织中相对稳定，若T细胞总数或CD4+/CD8+ T细胞的比值发生改变，即可视为免疫调节功能异常。HBV感染初期HBV特异性CD8+ T细胞能通过IFN-γ和TNF-α介导非细胞毒性溶解机制完全有效清除HBV病毒而不引起免疫损伤[8-9]，随CD4+ T细胞数目下降，特异性CD8+ T细胞数目减少、非特异性CD8+ T细胞却多，破坏肝细胞引起肝脏损伤。细胞因子，特别是IFN-γ及TNF-α有重要作用，目前有研究认为TNF-α与清除HBV DNA及其复制中间体有关[10]；体外实验证明，采用患者外周血单个核细胞，相当浓度（170 μg/mL）的IFN-γ能抑制离体肝细胞内HBV-DNA复制[11]，IFN-γ可能作为一个细胞活化的标志。本研究结果表明：不同HBV-DNA载量HBV患者CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+水平均低于健康人（P < 0.05），而IFN-γ和TNF-α水平较健康人则显著升高（P < 0.05）。在急性HBV感染患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+、IFN-γ和TNF-α明显增高（P < 0.05），说明免疫系统的多方面被激活，并可能在病毒清除方面起重要作用，但过强的免疫应答可能会造成大面积的肝脏快速坏死，出现急性或亚急性肝衰竭，预后较差。急性自限性HBV感染患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+和健康人比较差异无统计学意义（P > 0.05），但IFN-γ和TNF-α显著升高（P < 0.05），机体的细胞免疫和体液免疫应答能很好地清除病毒，急性自限性肝炎是理想的临床转归。隐匿性HBV感染患者CD3+、CD4+、CD8+水平稍低于健康人，但差异无统计学意义（P > 0.05），说明这部分人体内没有活跃的病毒复制，细胞免疫功能尚保持基本正常。慢性HBV感染患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+水平显著减低（P < 0.05），说明慢性乙型肝炎患者体内病毒复制活跃，同时也可引发免疫病理损伤，介导了肝脏炎症和肝细胞坏死，整体而言，慢性HBV感染者针对HBV的特异性免疫功能受到严重抑制[12-13]。由于淋巴细胞是免疫系统行使功能的物质基础，其数量的显著下降必然造成功能上的缺陷，这些患者机体应答能力的减弱是造成HBV持续感染的原因。本研究结果提示机体的细胞免疫功能在HBV感染者的转归过程中扮演着十分重要的角色。

病毒性肝炎患者机体免疫功能低下，尤其是细胞免疫功能低下，是导致发病和使病情向慢性化转归的重要原因。因此，调节机体的免疫功能，尤其是增强细胞免疫功能，是治疗本病的重要原则之一。IFN-α是最早运用于抗HBV感染的药物，INF-α为具有抗病毒和免疫调节功能的细胞因子，因而具有双重治疗功效[13]。IFN-α可通过激活细胞内2'，5'-寡腺苷酸合成酶催化寡核苷酸合成，激活内源性核酸内切酶，以抑制病毒的mRNA信息的传递，从而阻止病毒在宿主细胞内繁殖。同时，IFN-a还增强细胞表面白细胞抗原Ⅰ、Ⅱ类分子表达，并通过细胞网络调节白介素（IL）-1、IL-2、TNF等的水平，促进细胞毒性T淋巴细胞增殖，激活NK细胞、巨噬细胞和功能靶细胞[14]。本研究结果表明，IFN-α治疗后及随访时的HBV-DNA转阴率均高于保肝护肝基础治疗（P < 0.05）。IFN-α抗HBV，除了直接降解病毒外，还具有免疫调节作用。因此，通过改善HBV患者细胞免疫功能状况的IFN-α来清除乙肝病毒是治疗HBV最有效方法之一，也是促使HBV感染者向好的方向转归的重要途径。

通过对HBV感染者细胞免疫状况分析及对疾病的转归影响分析，了解宿主细胞免疫状态与病毒间的调变关系及在慢性HBV感染中宿主免疫指标的消长规律。不仅完备了流行于我国的HBV的基础和临床资料，还对阐明HBV的发病机制，对指导临床诊断、治疗和预后以及预防工作都具有极其重要的理论意义和实用价值。本研究由于得到的只是一个横断面的资料，无法进行纵向研究，没有对HBV不同血清学模式与免疫功能状况之间的关系进行更进一步的研究，对不同细胞免疫功能状况在HBV转归的血清学模式的复杂作用规律，不能得到更精确的结论。但是不难得出，在HBV感染中，活跃的多克隆细胞免疫反应是必不可少的，机体细胞免疫功能状况是HBV患者转归的关键。

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（收稿日期：2014-11-11 本文编辑：苏 畅）