肖龙泉，任亚硕，吴德玲，汪天明

(1.安徽省亳州市人民医院，安徽 亳州　236804；2.安徽中医药大学，安徽 合肥　230038；

3.安徽省现代中药重点实验室，安徽 合肥　230038)



紫外分光光度法测定醉鱼草果实中总黄酮含量

肖龙泉1，任亚硕2,3，吴德玲2,3，汪天明2,3

(1.安徽省亳州市人民医院，安徽 亳州236804；2.安徽中医药大学，安徽 合肥230038；

3.安徽省现代中药重点实验室，安徽 合肥230038)

摘要:目的建立醉鱼草果实中总黄酮的含量测定方法。方法采用紫外分光光度法，以芦丁为对照品，通过亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠系统显色法测定醉鱼草果实中总黄酮的含量。结果芦丁在8.56~51.36 mg·L-1范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系(A=0.012 0C-0.007 1，r=0.999 8)，平均加样回收率为98.76%，相对标准偏差为1.74%(n=6)，所测得醉鱼草果实中总黄酮含量为5.29%。结论该方法操作快速、简便，结果准确可靠，可用于醉鱼草果实中总黄酮成分的含量测定。

关键词:醉鱼草果实；总黄酮；紫外分光光度法；含量测定

醉鱼草果实药材是马钱科植物醉鱼草(BuddlejalindleyanaFort.)的果实，具有祛风除湿、止咳化痰、散瘀之功效[1]。文献报道醉鱼草属植物中含有丰富的化合物种类，包括黄酮类，三萜类及苯乙醇苷类等[2-5]，其中黄酮类成分，具有多种药理活性[6-7]。经前期研究发现，醉鱼草果实中同样含有丰富的黄酮类化合物[8]，主要为芦丁、槲皮素、木犀草素等，是其主要药理活性成分，其中芦丁是一种脱氢黄素酮的糖苷，在各类植物中普遍存在，且含量较高。醉鱼草果实中黄酮类含量的测定方法未见报道，为了进一步研究醉鱼草果实中的黄酮类成分，本研究选用芦丁作为对照品，通过经典的亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法[9-10]，建立了醉鱼草果实中黄酮类成分的含量测定方法。

1仪器与试剂

紫外-可见分光光度计(UV-757CRT型，上海精科)；电子分析天平(AB135-S，瑞士METTLER TOLEDO)；HH-S恒温水浴锅(江苏金坛市国胜实验仪器厂)；高速中药粉碎机(FZ-02，浙江省温岭市百乐粉碎设备厂)。芦丁对照品(批号：100080-200306：中国药品生物制品检定所)；醉鱼草果实(于2008年12月采自安徽舒城万佛山，经安徽中医药大学药学院刘守金教授鉴定为马钱科植物醉鱼草的果实)；亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，甲醇等均为分析纯；水(实验室自制超纯水)。

2方法及结果

2.1对照品及供试品溶液的制备精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36 h芦丁对照品10.7 mg，置50 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容至刻度即得；芦丁对照品溶液浓度为0.214 g·mL-1。精密称取醉鱼草果实粗粉1 g，置50 mL圆底烧瓶中，加甲醇20 mL回流提取提取3次，每次1 h，合并滤液，并定容至100 mL，即得供试品溶液。

2.2检测吸收波长的确定分别精密吸取上述对照品溶液6.0 mL、供试品溶液3.0 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸馏水至6 mL，再加入5%的NaNO2溶液1 mL，摇匀后静置6 min；加10%Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀后静置6 min；加4%NaOH溶液10 mL，加水定容至刻度，摇匀后静置15 min。紫外—可见分光光度仪全波长扫描的结果显示，对照品及供试品溶液在510 nm波长处显示有较强吸收峰，因此选定510 nm作为检测波长，见图1。

注：(a)和供试品溶液(b)紫外扫描图。

2.3标准曲线的建立分别精密吸取芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，均加入蒸馏水至6 mL，按“2.2”项下步骤操作，以第一份作为空白对照，在510 nm处测定各对照品溶液的吸光度值。吸光度值分别为0.099,0.195,0.301,0.404,0.505,0.612。以吸光度值(A)为纵坐标，芦丁对照品溶液浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：A=0.012 0C- 0.007 1 (r=0.999 8)，结果表明芦丁在8.56~51.36 mg·L-1浓度范围内呈良好的线性关系。

2.4精密度考察精密吸取同一供试品溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.2”步骤中的方法显色，重复测定6次，吸光度值分别为：0.247,0.246,0.246,0.245,0.248,0.247。计算其吸光度值的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)=0.43%。结果表明仪器精密度良好。

2.5稳定性考察分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各1 mL于25 mL容量瓶中，按“2.2”步骤操作，测定吸光度，每隔5 min测定一次，连续25 min，考察其显色稳定性。吸光度值分别为：0.247,0.245,0.245,0.241,0.243,0.242。结果表明，供试品及对照品溶液在显色系统完全反应后25 min内，具有良好稳定性。

2.6重复性考察分别精密称取醉鱼草果实粗粉1 g，共6份，按“2.2”步骤制备供试品溶液并测定其吸光度，吸光度值分别为：0.251,0.242,0.249,0.255,0.245,0.243。计算得药材中总黄酮含量平均值为5.29%，RSD=1.83%。结果表明重复性良好。

2.7加样回收率试验分别精密吸取含量已知的醉鱼草果实供试品溶液1 mL，6份，置于25 mL容量瓶中，各加入芦丁对照品溶液2.5 mL，按“2.2”步骤，测定吸光度，计算加样回收率及RSD，结果见表1，表明本方法结果准确可靠。

表1　加样回收率试验

2.8样品含量测定精密称取醉鱼草果实粗粉1 g，甲醇回流提取3次，每次1 h，滤液合并后，用甲醇定容至100 mL容量瓶，平行测定3组，按“2.2”步骤显色并测定吸光度，计算得供试品中总黄酮含量分别为5.28%、5.32%、5.41%，平均含量为5.34%。

3讨论

3.1供试品的提取醉鱼草果实含多种黄酮类化合物，黄酮类化合物的提取实验前期分别采用纯水、不同浓度的乙醇及甲醇作为提取溶媒，考察醉鱼草果实中总黄酮含量，结果发现甲醇回流提取时，所测得药材中总黄酮含量最高[11]，进而选定甲醇为醉鱼草果实药材的提取溶剂。

3.2测定方法的确定黄酮成分的分析测定方法主要包括薄层扫描法、HPLC法、紫外分光光度法等。波层扫描法测定醉鱼草果实中总黄酮的影响因素太多，测定结果不理想。总黄酮中成分种类较多，通过HPLC法测定每个黄酮成分的含量，来测定总黄酮的含量也并不现实。醉鱼草果实中黄酮类化合物的紫外区间的吸光度值虽不一致，但其黄酮母核能与亚硝酸钠—硝酸铝—氢氧化钠系统反应，通过被亚硝酸钠还原，再加硝酸铝络合，在碱性条件下显红色，在510 nm处有较强吸收，吸收峰稳定无干扰，根据显色后吸光度的不同，可实现对其黄酮类成分的测定，既能有效避开其他成分对黄酮测定的影响，又能保证结果的准确性[12]。在实验中还发现，显色反应会随着显色温度和显色时间的变化而变化，25 min内变化较缓，25 min后其吸光度值会下降，因此实验过程中应严格控制条件，尽量排除干扰。

本文以芦丁为对照品，采用亚硝酸钠—硝酸铝—氢氧化钠法，测定醉鱼草果实中黄酮类成分的总含量，结果显示该法操作快速、简便，结果准确可靠，可作为醉鱼草果实总黄酮的含量测定方法。

3.3应用前景醉鱼草作为中医的传统药材，但其果实的研究较少，这不利用醉鱼草资源的综合开发，本研究通过紫外分光光度法测定醉鱼草果实中总黄酮含量，建立了醉鱼草果实总黄酮的含量测定方法，为醉鱼草这一传统药用资源的综合利用提供了参考依据。

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Determination of flavonoids in the fruits of

BuddlejalindleyanaFort.by ultraviolet spectrophotometry

XIAO Long-quan1,3,REN Ya-shuo2,3,WU De-ling2,3,et al

(1.ThePeople’sHospitalofBozhou,Anhui236804,China;2.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityof

TraditionalChineseMedicine,Anhui,Hefei230038,China;3.AnhuiKeyLaboratoryofModernized

ChineseMaterial,Hefei,Anhui230038,China)

Abstract:ObjectiveToestablishamethodfordeterminingtotalflavonoidsinthefruitofBuddleja lindleyanaFort.MethodsThecontentoftotalflavonoidswasdetectedbyultravioletspectrophotometry(US) .Itwasperformedonrutin(asacontrol)andasamplewithsodiumnitrite-aluminumnitrateandsodiumhydroxideascolor-developingagent.ResultsThegoodlinearitybetweenconcentrationsandabsorbanceofrutinwasfoundwithintherangeof8.56to51.36mg·L-1(A=0.012 0 C-0.007 1，r=0.999 8).Theaveragerecoverywas98.76%andrelativestandarddeviationwas1.74% (n=6).ThefruitofBuddleja lindleyanaFort.contained5.29%oftotalflavonoids.ConclusionsThismethodcanbeusedfordeterminingflavonoidsinthefruitofBuddleja lindleyanaFort.becauseofitsrapidness,simplicity,accuratenessandreliability.

Keywords:fruitsofBuddleja lindleyanaFort.;totalflavonoids;ultravioletspectrophotometry;contentdetermination

(收稿日期：2014-02-11，修回日期：2014-05-27)

通信作者：吴德玲，男，教授，研究方向： 中药活性成分研究，E-mail:dlwu7375@sina.com

基金项目：国家自然科学基金(No81373841)；安徽省教育厅自然科学研究重点项目(NoKJ2013A170)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.017