张　萍，吴　敏，汤　慧，朱应成

(安徽省芜湖市食品药品检验所，安徽 芜湖　241000)



基于HPLC-DAD方法建立的数字对照品库检索平台用于鸡蛋中四环素类药物残留的快速筛查

张萍，吴敏，汤慧，朱应成

(安徽省芜湖市食品药品检验所，安徽 芜湖241000)

摘要：目的建立了同时检测鸡蛋中8种四环素类药物残留的HPLC-DAD方法，建立了它们的相对保留时间和多波长检测的峰面积比值数据库，通过数据库建立了一个数据检索平台，并将其用于鸡蛋中的四环素类药物的残留的快速筛查。方法先建立起一个同时检测8种药物的HPLC-DAD色谱分析方法，然后根据所得的HPLC-DAD色谱图中对照品的信息，建立起一个包含各对照品的相对保留时间比值和多波长检测峰面积比值的数据库，并以此为基础建立起一个检索平台；实际检测时，如果样品中出现可疑物质，则可将疑似峰的保留时间和多波长检测的峰面积输入库中进行检索，达到快速筛查的目的。结果8种四环素类药物在建立的色谱条件下实现了完全分离；数字对照品检索数据库在实际检测中，显示出简单方便，准确可靠的优势。结论该方法建立的数字对照品库可以代替实际对照品，在监督现场对鸡蛋中是否含有四环素类药物残留进行快速筛查和检定。

关键词：鸡蛋；四环素类药物；残留；数字对照品库；现场快速筛查

Rapid determination of eight tetracycline residues in eggs by a

search platform using numerical reference substance database

四环素类是由链菌霉产生的一类广谱抗菌素[1-3]，因其价格低、抗菌谱广、饲料报酬高等优点在畜禽和水产养殖业中被广泛地应用。此类药物主要包括四环素、土霉素、金霉素，脱氧土霉素、米诺环素等。 在我国对于此类药物在动物养殖过程中的使用有严格的限制，但是一些养殖户为了追求经济利益，长期违规使用此类抗生素，造成该类药物在禽类产品中大量残留，极大的影响了兽药的治病疗效，也给人的身体健康带来严重危害。

鸡蛋含有人体几乎所有需要的营养物质，被人们称做“理想的营养库”，每个人几乎每天都会食用鸡蛋，因而蛋品的安全是关系到亿万国民健康和生命的头等大事。国内外有关检测四环素类药物残留的高效液相色谱法已有报道[4-6]，但多数检测方法繁琐、灵敏度偏低、尤其是在等度洗脱的状态下只能同时检测3~4种四环素类药物。近年来，HPLC-MS/MS检测四环素类药物的报道亦逐渐增多[7-8]，但是由于其仪器昂贵、操作复杂，使用和维护费用高，对于日常的食品安全监督来说不易推广，因此并不是常规检测的首选方法。

本文利用基层检验部门现有的检测仪器，建立了能同时检出8种四环素类药物的HPLC-DAD检测方法。另外借鉴了目前在中药检测中推广的“一测多评”的方法[9-11]以及HPLC-DAD法中多波长定性测定法[12]的思路，以HPLC-DAD数据为基础建立了一个数字对照品数据库，该数据库由8种药物的相对保留时间比值和4个波长下的峰面积比值组成，在工作中它们可以代替实际对照品对样品进行快筛，可以一次性检测多种残留药物，大大缩短了检测时间，降低了检测成本，提高了检测效率，可以在普通实验室中普及。另外本法的等度洗脱模式非常适用于快检车载高效液相色谱仪。本研究为快速准确的筛查鸡蛋中的是否含有四环素类抗生素残留药物提供了一个很好的方法学参考。

1仪器与试药

1.1仪器及主要设备Waters液相色谱仪(2998 PAD检测器，Empower 2工作站)，Gemini C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱，Mettler XP205十万分之一天平。

1.2试剂与对照品4-差向四环素 (130401-200209，含量测定用)，土霉素 (130487-200703，88.8%)，脱水差向四环素(130402-200203，含量测定用)，美他环素(130499-200101，90.1%)，盐酸四环素 (130488-200403，97.5%)，多西环素(130405-200405，含量测定用)， 盐酸金霉素 (130489-200202，95.3%)，米诺环素(130514-200401，85.1%)，上述对照品均来自中国食品药品检定研究院。

甲醇、乙腈均为色谱纯，高氯酸酸为分析纯，水为超纯水。

1.3实验样品鸡蛋样品来自芜湖的大型超市和农贸市场，共取点20个，取样品45批次，样品类型有普通鲜鸡蛋、山鸡蛋、土鸡蛋、草鸡蛋、头窝蛋和本鸡蛋。

2方法与结果

2.1原理

2.1.1相对保留时间定性原理相对保留值α也叫选择因子，是某组分X(待测物) 与另一组分 (参照物) 的调整保留值之比值(α =tRx/tR参)，在色谱条件一定的情况下，它只受柱温和固定相的影响，与其它色谱操作条件无关，所以用α定性可以消除某些条件的影响，也是色谱学上使用广泛的一种定性方法。在固定色谱操作条件下，可以在HPLC色谱图上选择一个色谱峰为内参照峰，然后将同一色谱图中其他各峰的保留时间与其相比得到一系列的相对保留值α，当进行未知物质检测时，在同样的色谱条件下，若未知峰的相对保留值与其中某一个相对保留值α相同，则可认为它们为同一物质。

2.1.2多波长定性原理朗伯-比耳定律为：A =kC，在高效液相色谱中，A表示峰面积，C为溶液的浓度，k为常数。在第1个波长处, 峰面积与浓度的关系为A1=k1C，在第2个波长处, 峰面积与浓度的关系为A2=k2C , 两个波长的峰面积之比为A1/A2=k1C/k2C =k1/k2= 常数。在试验中选择灵敏度较高的4个波长, 计算其中1个的峰面积与其它3个峰面积之比, 得到的数值分别以R1，R2，R3表示。若色谱条件不变, 则每次测定的R1，R2，R3这一组数据也不变。依据这一组数据可对未知组分进行准确定性。

2.2方法

2.2.1对照品储备液及混合对照品溶液的制备准确称取4-差向四环素，土霉素，脱水差向四环素，美他环素，盐酸四环素，多西环素，盐酸金霉素，米诺环素对照品各适量分别置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并稀释制至刻度，制成相应的浓度约为1 g·L-1标准储备溶液，储备液冷藏保存，保存期为2个月。

精密量取4-差向四环素，土霉素，脱水差向四环素，美他环素，多西环素对照品储备液1 mL，盐酸四环素和米诺环素对照品储备液2 mL及盐酸金霉素3 mL同置于20 mL的容量瓶中，加流动相稀释至刻度即得混合对照品储备液。

2.2.2鸡蛋的处理取鸡蛋两枚，用料理机混匀后，取混匀样品5 g，置锥形瓶中，精密加入5%高氯酸酸溶液25 mL，25℃超声20 min，放冷至室温后，取上清液过滤后备用。

2.2.3液相色谱条件取对照品的混合储备液，过滤后进液相色谱仪，色谱条件如下：色谱柱： Gemini C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：[0.15 mol·L-1醋酸铵溶液-0.01 mol·L-1EDTA-三乙胺(100 ∶10∶1)(用醋酸调节pH至8.5)]：乙腈(81∶19)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；检测波长：DAD扫描范围为190~400 nm，图1为其中4个波长下的色谱图。从图中可以看出各色谱峰与其相邻峰的分离度良好分离度值在1.5～5.8范围内。各峰的理论塔板数也较高，均不低于4 000。

图18种四环素类药物在不同波长处的色谱图

注：1.4-差向四环素；2.土霉素；3.脱水差向四环素；4.美他环素；5.盐酸四环素；6.多西环素；7.盐酸金霉素；8.米诺环素。

2.3数字对照品谱库的建立

2.3.1相对保留时间数据库的建立实验中将米诺环素选为内参物质，通过其他峰的保留时间和它进行比较得到了一系列的相对保留值，结果如下表1。从表中的结果可以看出使用相同的色谱柱，每种物质在不同的色谱仪上的相对保留值变化不大，表明使用同一根色谱柱，在相同的色谱条件下以相对保留值对色谱峰进行定性准确性良好。

2.3.2基于多波长测定的峰面积比值数据库的建立多波长测定是HPLC-DAD方法中一种比较简单的定性的方法。因各组分在不同波长处的峰面积之比为一组定值，故可选择4个或多个灵敏度较高的波长进行同时检测，再选择其中1个波长与其它波长处的峰面积相比，得到一组定值，建立起一个面积比值的标准数据库。我们计算了355 nm波长处的峰面积与270 nm、370 nm和390 nm波长处峰面积的比值A270/A355，A370/A355，A390/A355，将这3个峰面积之比分别以R1，R2，R3表示，色谱图见图1。我们选择不同质量浓度的对照品溶液，测定了8 种药物在4个波长处的峰面积，计算了它们的峰面积之比，10次测定结果如表2。从表2中可以看出，10次测定的峰面积比均在一定的范围内。

2.3.3数字对照品库检索平台的建立及样品的检测本文将“2.3.1”和“2.3.2”中相对保留时间比值和多波长测定的峰面积比值数据库通过Excel表格的编程功能集成为一个8种四环素类药物的数字对照品检索平台。在现场快筛时如果样品中出现了可疑物质，则可将样品的HPLC-DAD色谱图中可疑峰的保留时间和内参米诺环素峰的保留时间输入检索平台中的相对保留时间比值数据库中，数据库直接就会得出是否为以下的哪种可疑物质；然后再将样品可疑峰的多波长检测的峰面积输入检索平台的峰面积比值数据库中，数据库直接就会判定出该可疑物质的具体品种。

表1　相同色谱柱上8种四环素类药物在不同色谱仪上的相对保留时间比值

注：A为Gemini C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；B为Luna C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

表2　8种四环素类药物在4个波长下的峰面积比一览表

3讨论

3.1色谱条件的选择

3.1.1色谱柱的选择考虑到方法应用的通用性以及四环素类药物的分子中大多数含酚羟基和烯酸型羟基，具有一定极性，所以选择了检测分析中常用的C18反相柱。本实验考察了以下不同牌号的色谱柱，(1)Gemini C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱；(2)Luna C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱；(3) Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱；(4) Aglient ZORBAX SB C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱；(5) Kromasil C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱；(6)MG II C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱；结果表明8种药物在长柱上都达到了基线分离，而在短柱上的有的峰还不能完全分开，因此实验选用了长柱。

3.1.2流动相的选择本实验选用了几种文献报道的测定四环素类药物的流动相体系包括：甲醇—水—草酸、甲醇—磷酸氢二钠、乙腈—甲醇—醋酸、甲醇—乙腈—甲酸、醋酸铵—EDTA—三乙胺—乙腈，结果发现8种组分在醋酸铵—EDTA—三乙胺—乙腈体系中色谱保留行为较好，另外还考察了此体系各溶液间的不同配比以及流动相pH值对检测的影响，结果显示在本法所用流动相体系下，各组分间的分离度均达到了要求，并且峰形也较好。

3.1.3检测波长的选择利用二极管阵列检测器(DAD)，记录190~400 nm波长段的光谱图，通过观察混合对照溶液在该波长段的3D光谱图，发现在上述色谱条件下，在270、355、370和390 nm波长处8种物质的信号值响应较强，干扰较小，色谱分离度符合要求，因此选择在将上述波长作为检测波长。

3.2样品前处理条件的选择近年来对于鸡蛋样本前处理净化方法已有报道[13-14]，大部分都采用三氯乙酸-MeIlvaine-EDTA 为提取液进行多步提取，然后再过固相小柱净化，最后用氮气吹干后，再取合适的溶液进行稀释。这些方法都可以把基质中的四环素类抗生素提取出来，但使用的提取体系比较复杂，另外还要经过较为繁琐的过柱、淋洗、蒸发、浓缩等过程，不但被测组分容易损失，而且不利于今后在监督现场进行快速检验。本实验以5%高氯酸酸溶液为提取液，采用超声方法提取四环素类药物，提取液经滤膜过滤后直接就可以进样，这种方法也可以获得良好的提取效果，大大节约了净化时间和检测成本，非常有利于今后在食品监督现场的快检。

4结论

本实验建立了等度洗脱模式下HPLC-DAD方法同时检测鸡蛋中8种四环素类药物的高效色谱分析方法，然后利用HPLC-DAD色谱图的信息建立了一个数字对照品库的检索平台，此平台可以用来快筛鸡蛋中是否含有四环素类药物的残留。

本实验建立起来的检索平台虽然只包含了8种药物的数字对照品的数据，但是以此为方法学参考可以建立起包含更多种类的药物残留的综合检索平台，为今后的食品安全监督检查提供更为便捷和准确的快筛手段。

参考文献：

[1]Hu Yu, Hui Mu, Hu YM. Determination of fluoroquinolones, sulfonamides, and tetracycline residues simultaneously in porcine tissue by MSPD and HPLC-DAD [J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2012, 1: 76-81.

[2]杨开金.HPLC法测定四环素片的含量 [J]. 安徽医药, 2013,17(8):1308-1309.

[3]葛云芝，于小波，周光宏，等.高效液相色谱法同时测定鸡肉中3中四环素类抗生素残留 [J].食品科学,2013,34(10):180-183.

[4]吴宁鹏，班付国，方忠意，等. 鸡蛋中四环素药物残留量测定高效液相色谱法研究 [J]. 中国兽药杂志, 2009, 43(8):9-12.

[5]池利民，全则灵，张雪梅. HPLC测定猪肉食品中四环素族抗生素残留 [J]. 安徽农业科学, 2010,38(7):3548-3549.

[6]李继连，白雪梅，靳书刚，等. HPLC法测定鱼类肌肉组织中土霉素和四环素药物残留含量 [J]. 黑龙江畜牧兽医, 2011(9):74-75.

[7]钟伟龙，吴云普，吕飞，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中四环素类药物残留[J]. 农业灾害研究, 2012, 2(1): 33-35.

[8]连英杰，吴敏，黎翠玉， 等.直接提取-超高压液相色谱-电喷雾串联质谱法检测原料奶及奶制品中的四环素类抗生素[J]. 食品安全质量检测学报,2013,4(2): 489-495.

[9]李岑，杨红霞，肖远灿，等.一测多评法测定藏药当佐中没食子酸、羟基红花黄色素-A、桂皮醛及胡椒碱的含量 [J].药物分析杂志, 2011, 31(9):1658-1667.

[10] 魏锋，程显隆，马玲云，等.药品标准中替代对照品研究技术要求探讨 [J]. 中国药品标准, 2012, 13(1):12-15．

[11] 逄瑜，孙磊，金红宇，等.替代对照品法在中药多指标含量测定中的应用与技术要求探讨[J]. 药物分析杂志, 2013, 33(1):167-177.

[12] 陈笑梅，郑自强，施旭霞. 高效液相色谱多波长定性方法研究 [J].色谱,1999,17(2):1892-1899.

[13] 蒋天梅，冯三令，耿士伟，等.液相色谱串联质谱法测定鸡蛋中四环素类药物的残留 [J].农技服务, 2012, 29(4): 476-477.

[14] 玛尔江·巴哈提别克, 王彦, 王玉红, 等. 应用加压毛细管电色谱技术检测鸡蛋中四环素类农兽药残留的研究//全国生物医药色谱学术交流会(2010景德镇)论文集[C]. 景德镇,2010:7-11.

based on HPLC-DAD spectrums

ZHANG Ping, WU Ming, TANG Hui,et al

(WuhuInstituteofFoodandDrug,Wuhu241000,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a rapid determination of eight tetracycline residues in eggs by HPLC-DAD, including 4-epianhydrotetracycline oxytraoycline, epitetracycline hydrochloride, methacycline, tetracycline, doxycycline, chlortetracycline and minocycline. Based on the HPLC-DAD spectrums, a numerical reference substance database including the adjusted relative retention times and the peak area rations was developed. A data search platform was integrated with the database and used for rapid screening of eight tetracycline residues in eggs. MethodsFirstly, HPLC-DAD spectrums were collected. Then a numerical reference substance database including the adjusted relative retention times and the peak area rations was established. Based on this database, a digital reference substance search platform was set up. For a suspicious substance in testing, we can compare its relative retention time and the peak area rations with the information in the database to identify this substance.Results8 tetracyclines were well separated based on the chromatographic conditions. This method has been successfully applied to real sample analysis.ConclusionThe reference substance database can be used to rapidly screen the eggs to judge whether the tetracycline residues are in eggs when surveillance on-site .

Key words:eggs; tetracycline; residues; numerical reference substance database; rapid screening

(收稿日期：2014-04-10，修回日期：2014-06-22).

基金项目：2012年安徽省食品药品监督管理局科研项目(No 009)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.014