一株家禽羽毛角蛋白降解菌的分离与鉴定

贾良辉(1977-)，男，浙江义乌人，副教授，博士，主要从事微生物代谢工程和化学生物学研究。E-mail：jiaLianghui@nwSuaf.edu.cn

周童娜，杨文翰，赵江婷，赵婷婷，安晓英，颜华*，贾良辉*

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

[摘要]为了探寻降解家禽羽毛角蛋白的微生物资源，利用富集及驯化培养的方法，从家禽养殖场长期堆积废弃羽毛的土壤中，分离能够有效降解羽毛角蛋白的细菌，并对其降解效果进行初步研究，结果分离筛选出1株能以羽毛角蛋白为唯一碳氮源的菌株N01。经形态特征观察，生理生化特征鉴定和16S rDNA序列分析，初步鉴定其属于节杆菌属。系统发育树显示，该菌株与金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)的相似性最高，达99%，因而确定其为金黄色节杆菌。该菌株经过72 h发酵，对羽毛角蛋白的降解率达75%，表明该菌株对羽毛角蛋白有明显的降解作用。该菌株的分离鉴定为微生物降解利用家禽羽毛角蛋白提供了新的种质资源。

[关键词]羽毛角蛋白；角蛋白降解菌；分离；鉴定

现代农业的大力发展推进了家禽养殖业的规模化生产，但随之而来的家禽羽毛废弃物堆积问题日益突出，这不仅给周围生态环境带来严重的压力，而且造成了家禽羽毛蛋白质资源的浪费。家禽羽毛由近90%的角蛋白组成，富含动物所需的多种必需氨基酸，但家禽羽毛角蛋白的性质极其稳定，很难被一般的蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等)分解，因此家禽对其消化率较低[1-2]。但是，家禽羽毛角蛋白经过有效降解后可以加工成动物饲料[3]。传统的高温高压降解和酸碱水解工艺可在一定程度上提高羽毛蛋白消化率，但这些方法往往会破坏一些氨基酸，同时存在能耗大、三废不易处理等问题，极易造成环境污染，而且饲料消化和利用率不高[4-5]。近年来，微生物降解法作为一种既经济又环保的举措引起了人们广泛关注。该方法在不破坏氨基酸的基础上能够改变角蛋白结构，同时具备消耗少、污染小的特点，在最大程度上提高家禽羽毛的营养价值和利用率[4]，促进了家禽羽毛在饲料业的发展。

土壤中降解角蛋白的微生物包括真菌、细菌和放线菌等，目前分离得到的细菌大多属于芽孢杆菌属，包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)和蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)[6-10]等，菌种资源单一限制了降解角蛋白微生物资源的开发与利用。本研究从长期堆积废弃羽毛的土壤中，分离到一株能高效降解羽毛角蛋白的细菌，并对其进行了分类鉴定、系统发育分析及降解特性的研究，丰富了角蛋白降解菌的微生物资源。

1材料与方法

1.1　材　料

1.1.1土样供试土壤采自陕西省杨凌区崔西沟某养鸡场长期堆积废弃羽毛处。

1.1.2羽毛粉将鸡羽毛用洗涤剂揉搓洗净，并用自来水彻底冲洗，剪去羽毛梗头部，121 ℃高压灭菌1 h，然后90 ℃烘24 h后粉碎，过100目筛。

1.1.3培养基选择培养基：羽毛粉10.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.4 g，琼脂粉 20.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

发酵培养基：羽毛粉10.0 g/羽毛10根，NaCl 0.5 g，K2HPO40.7 g，KH2PO40.35 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

种子培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.4 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

LB(Luria-Bertani)培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂粉 20.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.5。

1.2　方　法

1.2.1微生物的分离筛选称取1 g土样加10 mL无菌生理盐水充分混匀，将其梯度稀释后涂布在含有1%的羽毛粉作为唯一碳氮源的选择培养基上，筛选出产水解圈的菌落。将其接入发酵培养基中扩大培养，观察羽毛降解情况，选取羽毛降解最彻底的菌株划线分离纯化，从而在土壤中分离得到一株能够降解羽毛角蛋白的菌株，暂定名为N01。

1.2.2菌落形态观察将菌株N01接种在LB培养基平板上，于37 ℃下恒温培养24~96 h。肉眼观察菌落的形状、颜色、表面质地、透明度和菌落边缘。

1.2.3菌体形态观察将菌株N01制片进行革兰氏染色后，在光学显微镜下观察菌体的形态。

1.2.4生理生化特征测定参照《微生物分类学》[11]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[12]进行菌株N01生理生化特性的测定。

1.2.516S rDNA序列测定与系统发育分析用菌株N01的基因组DNA作模板,以16S rDNA通用引物进行16S rDNA的扩增。上游引物：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，下游引物：1522R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')。扩增反应体系：10×PCR Buffer(with MgCl2) 5.0 μL，dNTPs(25 mM) 4.0 μL，引物(10 μM)各1.0 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL，模板 1.0 μL，补ddH2O至50.0 μL。扩增反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；50 ℃复性30 s；72 ℃延伸2 min，33个循环；72 ℃长延伸10 min。PCR扩增产物胶回收后克隆至pMD18-T载体，转化E.coliDH5α，阳性克隆委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将菌株N01的16S rDNA序列，在GenBank网站中进行 BLAST分析，通过Mega 5.0以Neighbour-Joining方法构建系统发育树，用Bootstrap(重复数为1 000)进行检验。

1.2.6角蛋白降解效果观察以接种环挑取一环菌物接种于种子培养基，37 ℃，180 r/min振荡培养24 h，作为种子液。种子液以4%接种量接种到含一根完整羽毛的100 mL发酵培养基中摇瓶发酵，以不接种的培养基作对照。37 ℃，180 r/min振荡培养数天，观察培养液中羽毛的降解情况。

1.2.7角蛋白降解率测定采用失重法测定[13]。以接种环挑取一环菌物接种于种子培养基，37 ℃，180 r/min振荡培养24 h，作为种子液。种子液以4%接种量分别接种于装有50 mL羽毛粉发酵培养基的250 mL锥形瓶中，37 ℃，180 r/min振荡培养72 h，3 000 r/min 离心10 min，取残渣至干燥箱内干燥至恒重，计算降解率。角蛋白降解率(%)=(羽毛粉干重-残渣干重) / 羽毛粉干重×100。

1.2.8菌株发酵实验将菌株N01接种于羽毛粉发酵培养基中，分别于不同温度条件下：24 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃ 和37 ℃，180 r/min振荡培养96 h，测定菌株N01发酵的最适温度。

1.2.9角蛋白酶活力的测定参照文献[14]进行菌株N01角蛋白酶活力的测定。

2结果与分析

2.1　菌株筛选鉴定

2.1.1菌落形态特征菌株N01分离自以羽毛角蛋白作为唯一碳氮源的选择培养基(见图1)，将其接种在LB培养基平板上，37 ℃恒温培养24~96 h后观察菌落形态特征，发现菌落呈圆形，凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐，不透明。幼龄菌落呈乳白色，随着菌龄的增长菌落逐渐呈金黄色，见图2。

2.1.2菌体形态特征菌株N01在LB培养基平板上37 ℃恒温培养24 h，6 h培养物镜检后，发现绝大部分细胞呈球状，仅个别细胞为短杆状；24 h培养物镜检后，发现大部分细胞呈不规则杆状，呈V字排列。

2.1.3菌株生理生化特征菌株N01革兰氏呈阳性，能利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇，不能利用乳糖，对木糖和鼠李糖利用情况不明。菌株N01在不含NaCl的培养基中生长良好，随着盐浓度的增大，菌株生长明显受到抑制。菌株N01在pH 5.0~8.0范围内生长良好，说明菌株N01的适应范围较广。菌株N01的生理生化特征见表1。

2.1.416S rDNA测序和系统发育分析N01 16S rRNA基因扩增电泳结果如图3所示。测序结果显示，菌株N01 16S rDNA序列全长为1 475 bp(Gene Bank登录号为NR 074272.1)，在GenBank数据库中进行Blast分析，根据同源性比对结果，通过Mega 5.0软件采用Neighbour-Joining方法构建系统进化树，结果如图4所示。菌株N01与Arthrobacteraurescens(金黄色节杆菌)的进化距离最近，结合形态观察与生理生化特征，初步鉴定N01为金黄色节杆菌，命名为ArthrobacteraurescensN01。

图1　菌株N01在选择培养基上的生长情况

图2　菌株N01在LB培养基上的菌落形态

Fig.2 Colony morphology of the strain N01 on LB medium

表1　菌株N01的生理生化特征

注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应；“+-”表示结果不确定。

Note:“﹢” denotes positive;“﹣” denotes negative;“﹢﹣” denotes the variable result.

图3　菌株N01 16S rDNA序列的PCR扩增结果

2.2　角蛋白降解

2.2.1角蛋白降解效果观察随时间的增加，发酵培养基由清亮逐渐变得浑浊。培养基中的完整羽毛，先是羽毛小枝逐渐脱落，小枝羽毛完全脱落后只剩羽毛梗，随后羽毛梗逐渐断裂，培养9 d后羽毛梗完全降解，培养基成为均一的混悬液(如图5所示)。对照组的羽毛基本没有变化。

2.2.2角蛋白降解率100 mL发酵培养基装入500 mL三角瓶中，30 ℃，180 r/min振荡培养72 h，测得角蛋白降解率为75%。

图4　邻接法构建的菌株N01 16S rDNA序列的系统发育树.系统发育树分支上的数值表示可信度，标尺表示分支距离

图5　Arthrobacter aurescens N01发酵9天降解羽毛效果

2.3　菌株N01降解角蛋白最适温度

温度对菌株角蛋白降解率的影响见图6。从图中可知，菌株降解角蛋白的最适温度是30 ℃，低于或高于30 ℃角蛋白降解率都迅速下降，这是由于温度过低不利于菌体的生长，延缓了角蛋白酶的产生，从而抑制了角蛋白的降解；温度高于30 ℃虽对菌体生长影响不大，却抑制了角蛋白酶的活性，从而导致角蛋白降解率的下降。

2.4　角蛋白酶活力

菌株ArthrobacteraurescensN01接种于100 mL羽毛粉发酵培养基中振荡培养，20 h就可以检测到明显的角蛋白酶活性，72 h角蛋白酶活性达到最高，为14 U/mL。在30 ℃，180 r/min培养96 h的条件下，菌株的角蛋白酶酶活变化见图7。

图6　温度对Arthrobacter aurescens N01角蛋白降解率的影响

图7　菌株Arthrobacter aurescens N01角蛋白酶酶活的测定

3讨论

家禽羽毛角蛋白中，苏氨酸、赖氨酸等氨基酸的含量高于豆粕，有效降解的羽毛粉可以代替5%~10%的豆粕作为蛋白质饲料[15]。微生物降解法不仅能有效降解家禽羽毛角蛋白，而且可以改善蛋白的结构，促进动物生长，从而代替部分豆粕。该方案在缓解蛋白质饲料紧缺问题的同时，既节省了蛋白质资源，又降低了生产成本[16-17]。

目前已发现30余种能降解角蛋白的微生物，分别属于真菌、放线菌和细菌[18]。真菌中的皮肤癣菌和白假丝酵母(Candidaalbicans)，放线菌中的链霉菌(Streptomyces)和高温单胞菌属(Thermonspora)及细菌中的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)都是降解角蛋白的主要类群[19-21]。降解角蛋白的真菌最早被研究，不过这些真菌往往具有致病性，所以具备商业开发价值的菌株为数不多。然而，研究发现金黄色节杆菌(Arthrobacteraurescens)不仅对Zn2+、Pb2+、Cd2+、Cu2+和Co2+等重金属具备较高的抗性水平[22]，而且能分泌产生高效、安全的新型溶栓酶，用于治疗心脑血管疾病[23]，可见该菌株的筛选不仅丰富了降解羽毛微生物的种类，而且在饲料业具备较好的应用前景，为家禽羽毛废弃物在蛋白饲料和医药卫生[24]方面的应用提供了优良菌株。在发酵实验中，该菌在温度30 ℃，pH 6.0的条件下表现出较高的羽毛降解能力和酶活性，对于其最佳发酵条件、酶学性质及降解羽毛的机理还有待进一步深入研究。

4结论

本研究从家禽养殖场长期堆积废弃羽毛的土壤中，分离到一株新的能有效降解羽毛角蛋白的细菌，通过形态学观察、生理生化特征研究和系统发育分析，初步鉴定为金黄色节杆菌ArthrobacteraurescensN01。迄今为止，国内外还未见该菌用于降解羽毛角蛋白的相关报道,这说明菌株N01是目前研究降解羽毛微生物的一个新成员。

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Isolation, Identification and Characterization of One Strain of New Feather-Degrading Bacteria

ZHOU Tong-na, YANG Wen-han, ZHAO Jiang-ting, ZHAO Ting-ting,

AN Xiao-ying, YAN Hua, JIA Liang-hui

(CollegeofLifeSciences,NorthwestA&FUniversity,Yangling，Shaanxi712100,China)

Abstract:The aim of this study was to obtain feather-degrading bacteria, investigate its degradation effect, and develop the exploitation and utilization of feather-keratin resources, especially new process of feather-biodegradation by microorganisms. A strain was isolated from environment soil collected from the chicken feather waste site of a local poultry farm by the method of enrichment and domestication. It can grow by using feather as the sole source of carbon and nitrogen. The strain was preliminarily identified by morphology observation, physiological and chemical characteristics and phylogenetic analysis as the Arthrobacter. Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of the strain had the highest sequence identity with Arthrobacter aurescens (99%). Based on 16S rDNA sequence analysis as well as physiological and biochemical property, the strain was identified as Arthrobacter aurescens N01. The degradation rate of feather was up to 75% after 72 h fermentation. It can be seen this bacterium has a strong effect on degradation of feather. Up to date, feather degradation by Arthrobacter has not been reported by far, thus, we provid a new efficient keratin-degraded bacterium to utilize feather.

Key words:feather keratin; feather-degrading bacteria; isolation; identification

[中图分类号]S811.6

[文献标识码]A

[文章编号]1005-5228(2015)11-0037-05

*[通讯作者]颜华(1976-)，女，山东宁阳人，副教授，博士，主要从事微生物分子遗传与分子代谢工程研究。E-mail：yanh99@gmaiL.com

[作者简介]周童娜(1989-)，女，榆林米脂人，在读硕士，主要从事微生物分离及萜类生物合成途径中相关酶研究。E-mail：zhoutongna@163.com

[基金项目]引进人才专项(Z111021104)；引进人才专项(Z111021105)和2014年大学生创新创业训练计划(201410712074)

*[收稿日期]2016-06-16修回日期：2015-07-12