科学研究

隆林山羊ACSS2基因的克隆及序列分析

曹艳红1，周恒1*，朱江江2，3，史怀平3，莫柳忠1，张彩珠1

(1.广西壮族自治区畜牧研究所,广西家畜遗传改良重点实验室， 广西 南宁530001；2.西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用实验室，四川 成都 610041；3. 西北农林科技大学 动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西 杨凌712100)

[摘要]根据藏系绵羊的ACSS2基因序列设计克隆引物，并以隆林山羊肌间脂肪组织为模板克隆ACSS2基因并测序。利用在线生物信息学软件分析ACSS2蛋白的序列特性，分析不同物种间ACSS2基因的进化关系及三级结构，从而预测隆林山羊ACSS2基因的功能。结果发现，隆林山羊ACSS2基因CDS全长 2 103 bp，由18个外显子组成，编码701个氨基酸残基。与牛(NM_001105339)、人(NM_018677)、绵羊(XM_012114899)、小鼠(NM_019811)序列的ACSS2基因相比较，核苷酸相似性分别为97.9%、91.5%、97.6%和88.2%，氨基酸的相似度分别为98.4%、93.6%、97.4%和91.9%。其中绵羊较山羊多出13个氨基酸(G279-Q291，GKPKEKPKHIRPQ)。隆林山羊ACSS2蛋白与其他物种间具有相似的三级结构系统，且与绵羊和牛具有较近的亲缘关系，而与猪的亲缘关系较远。

[关键词]隆林山羊; ACSS2；肌间脂肪；

随着人们生活水平的提高，富含高蛋白、低胆固醇的羊肉备受人们青睐。羊肉中含有多种不饱和脂肪酸，具有独特的营养保健功能，能够降低Ⅱ型糖尿病患者的血糖水平[1]，可以明显降低高脂血症患者的血脂水平等[2]。通过改变羊肉中脂肪酸组成，以此来改善羊奶风味和营养价值是现在肉羊育种的重要手段，然而现在关于羊肉中脂肪酸合成的分子机制还不是很清楚。

脂肪酸的从头合成是动物体内脂肪酸的重要来源[3]，乙酰辅酶A羧化酶和脂肪酸合酶催化了从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物的全过程，从而形成长链脂肪酸[4-5]。而其中乙酰辅酶A则是由乙酰辅酶A合成酶催化乙酸而形成[6]，从而用于脂肪酸的合成。乙酰辅酶A 合成酶(acetyl-Coenzyme A synthetase, ACAS)是乙酰辅酶A 中短链家族的成员之一。 编码乙酰辅酶A 合成酶的基因有两个，即ACSS1和ACSS2[7]。ACSS2 基因的表达由固醇调控元件结合蛋白(SREBP)调节, 而SREBP在脂肪代谢及胆固醇合成过程中起着重要作用[8-10]。因此, Lerez 认为ACSS2 基因有可能影响动物的生长和脂质性状[10]。Zachary等[11]发现，ACSS2能够促进细胞对乙酸的利用，并对维持癌细胞的生长提供了脂质底物。Chen等[12-13]发现，ACSS2通过调控HIF-2信号通路从而影响肿瘤细胞的胞内微环境。Bionaz等[14]发现，ACSS2在牛初乳、常乳和末乳中均有表达。与初乳相比, 常乳和末乳中ACSS2表达显著降低。可见，ACSS2在细胞脂质形成和脂代谢调控过程中具有重要作用。陈志成等[15]通过转录组测序技术得到了藏系绵羊ACSS2基因的cDNA序列。然而，现在还没有关于隆林山羊ACSS2基因序列及功能研究的报道。本研究采集隆林山羊肌间脂肪组织，并通过克隆ACSS2基因序列并进行序列分析，为进一步在山羊肌间脂肪酸细胞中研究其功能奠定基础。

1材料与方法

1.1　试验材料

采集广西畜牧研究所养羊研究室的2~3 岁、健康的3只隆林山羊为研究对象。屠宰后，迅速采集肌间脂肪组织，用DEPC水洗净后分装，迅速放入液氮罐中保存，用干冰运送至西北农林科技大学陕西省农业分子生物学重点实验室用于后续研究。DNA 片段快速回收试剂盒、 病毒基因组 DNA/RNA 提取试剂盒和高纯度质粒小提中量试剂盒、大肠杆菌 TOP10均购自北京天根生化科技有限公司；实时定量试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)和第一链 cDNA 合成试剂盒(Prime ScriptTMRT reagent Kit)均购自大连 TaKaRa 公司；LA Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ均购自大连TaKaRa 公司；pMD-T 载体购自大连TaKaRa 公司。

1.2　试验方法

1.2.1引物设计根据报道的藏系山羊的ACSS2基因序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6软件设计特异性克隆引物：PCR 引物采用 Primer Premier 5.0，克隆引物在 5′端分别引入XhoⅠ和EcoRⅤ酶切位点(划线部分)。上游引物TGCCTCGAGAGCCACC ATGGGACTTCCCGAAGAGCGGA, 下游引物CCGGATATCC TTGGATGGTCAAGCAGCG。

1.2.2RNA提取与cDNA合成利用Trizol一步法提取隆林山羊肌间脂肪组织总RNA，并用1%的琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA完整性，-80 ℃长期保存。第一链cDNA的合成按照Takara公司第一链cDNA合成试剂盒说明书操作。

1.2.3ACSS2基因的CDS区的克隆以隆林山羊肌间脂肪cDNA为模板，进行PCR扩增。其反应体系为：10×LA Buffer II(含Mg2+) 2 μL， dNTPs(2.5 μmol/L) 2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL， LA Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O 12.8 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，每个循环增加1 ℃,25个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。

扩增产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，用DNA快速回收试剂盒回收目的片度，并于16 ℃连接pMD-19-T载体；次日将连接产物转化TOP10感受态细胞，复苏后涂布于含有24 μg/mL X-gal及100 μg/mL Amp的LB培养皿表面，37 ℃ 培养12~16 h左右；挑取单个白色阳性菌落进行质粒提取和酶切鉴定，将含阳性重组质粒的菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.2.4序列分析利用NCBI中的blastn和blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)对测序得到的ACSS2基因序列进行同源性分析；通过BioXM 2.6软件对ACSS2的氨基酸序列进行物种间多序列比对；利用Splign进行外显子预测(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi?textpage=online&level=form)；利用Phyre2 进行三级结构预测 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index)[16]。利用MEGA5进行系统进化树分析。

2结果与分析

2.1　ACSS2基因的克隆

以总RNA为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，得到2 200 bp左右的扩增产物，与预期长度相符(图1)，并对提取的质粒进行酶切鉴定；测序结果显示，得到山羊ACSS2基因片段2 159 bp，其中CDS区全长2 103 bp，编码701个氨基酸残基，其起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。隆林山羊ACSS2基因与牛(NM_001105339)、人(NM_018677)、绵羊(XM_012114899)、小鼠序列(NM_019811)的ACSS2基因相比较，核苷酸相似性分别为97.9%、91.5%、97.6%和88.2%，氨基酸的相似度分别为98.4%、93.6%、97.4%和91.9% (图2)。其中绵羊较山羊多出13个氨基酸(G279-Q291，GKPKEKPKHIRPQ)。

图1　隆林山羊ACSS2基因的PCR扩增

图2　不同物种间ACSS2蛋白序列比对

2.2　ACSS2基因的系统进化树分析

为了探求ACSS2基因在不同物种间的亲缘关系，根据已经报道的不同物种的氨基酸序列进行了进化树分析，包括牛(NM_001105339)、人(NM_018677)、绵羊(XM_012114899)、小鼠(NM_019811)、猩猩(XM_009437081 、XM_004062044)、猪(NM_001143695)、猴子(NM_001265800)和大鼠(NM_001107793)。结果发现，山羊ACSS2与绵羊的亲缘关系最近，牛次之。反刍动物与灵长类(人、猩猩、猴子)和鼠类(大鼠和小鼠)具有较近的亲缘关系，而与猪的亲缘关系最远(图3)。

图3　ACSS2蛋白的生物进化树分析

2.3　ACSS2蛋白的三维结构分析

利用Splign软件对ACSS2进行外显子预测(利用牛的基因组作为参考)，结果发现，ACSS2处于13号染色体上，其CDS区由18个外显子区域构成[17]。同时利用Phyre2对牛(NM_001105339)、人(NM_018677)、绵羊(XM_012114899)和隆林山羊的蛋白三维机构进行了分析，发现山羊ACSS2与在不同的物种间具有相似的三级结构。推测山羊ACSS2和人、牛、绵羊的ACSS2具有相似的功能。

图4　ACSS2蛋白基因外显子分析(A)及

3讨论

ACSS2基因是动物体内乙酰辅酶A的主要来源，可以催化从外源摄取和糖代谢所产生的乙酸转变为乙酰辅酶A[18]，从而被脂肪酸合成所利用[11]。所以ACSS2在连接糖代谢和脂代谢的过程中具有重要作用。现在对于ACSS2的功能研究主要集中在人和小鼠中。Sarah等[19-21]表明ACSS2能够通过利用乙酸盐从而为人类肿瘤的生长提供碳的来源。Stuart等[22]发现过表达的ACSS蛋白能够通过将乙酸盐转化为乙酰辅酶A来引起免疫相关基因的组氨酸乙酰化从而引起对于急性酒精性肝炎的免疫反应。而在反刍动物中，Poonam等[23]发现ACSS2的表达与水牛乳产量呈现正相关关系，而与乳脂含量呈现负相关性。然而现在还没有关于山羊ACSS2功能的研究，本研究通过基因克隆等方法得到山羊ACSS2基因的序列，这些结果将为后续的功能研究提供参考。

隆林山羊是广西地区特有的山羊品种，具有生长快、发育快、体格硕大、繁殖率高、肉质好、适应性强、饲养成本低、屠宰率高等优点[24]，解析隆林山羊肌间脂肪脂肪酸的形成机制，改善山羊肉质是广西地区山羊育种的重要组成部分。然而现在关于隆林山羊ACSS2基因的序列和功能研究较少。陈志成等利用转录组测序的方法报道了藏系绵羊ACSS2基因的序列，然而由于不同的山羊品种间的差异，藏系绵羊的基因序列仅为隆林山羊的基因功能研究提供参考，但并不能作为最终的序列信息来使用。本试验中首次已以RT-PCR的方式克隆得到了隆林山羊ACSS2基因的CDS区，全长2 103 bp编码701个氨基酸残基，这与藏系绵羊的结果一致[15]。然而，本试验所得到的结果与藏系绵羊仍然有5个氨基酸的差异，说明在不同的羊品种间，其氨基酸序列并不完全一致。而这种差异是否会造成其功能上的差异还需要更进一步的验证。

山羊与绵羊虽然有着不同的染色体数目，但是却有着较近的亲缘关系。本研究中通过对ACSS2基因序列进行进化树分析发现隆林山羊与绵羊具有最近的亲缘关系，其次为同为反刍动物的牛，这与之前的研究结果一致[16，25]。而灵长类动人和猩猩，咧齿类动物的小鼠和大鼠为同一种属也证明了本结果的可靠性。

本研究发现，ACSS2基因在不同物种间有较高的相似性，然而绵羊ACSS2基因与山羊等其他物种相比较多出13个氨基酸(G279-Q291，GKPKEKPKHIRPQ)，但这种差异并没有造成蛋白三级结构的改变。虽然绵羊ACSS2蛋白与其他物种间的差异还需要更进一步的验证，而相似的三级结构也暗示ACSS2在不同物种间可能具有相似的功能。

4结论

隆林山羊肌间脂肪ACSS2基因CDS区序列,全长2 013 bp，编码701个氨基酸残基。绵羊ACSS2基因与山羊等其他物种相比较多出13个氨基酸(G279-Q291，GKPKEKPKHIRPQ)。隆林山羊ACSS2基因与绵羊具有最近的亲缘关系，牛次之，与猪的亲缘关系最远。

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Cloning and Sequence Analysis ofACSS2 Gene in Longlin Goat

CAO Yan-hong1, ZHOU Heng1*, ZHU Jiang-jiang2，3, SHI Huai-ping3,MO Liu-zhong1, ZHANG Cai-zhu1

(1.AnimalHusbandryInstituteofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning，Guangxi530005,China;

2.KeyLaboratoryofSichuanProvinceforQinghai-TibetanPlateauAnimalGeneticReservationandExploitationin

SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan610041，China;

3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity/ShaanxiProvincialKeyLaboratoryof

MolecularBiologyforAgriculture,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:The primers were designed according to the ACSS2 sequence of Tibetan sheep, CDS of ACSS2 was cloned and sequenced by RT-PCR. Using online tools, the sequence character, structure prediction and evolution analysis were performed, which may be helpful for the function prediction of ACSS2 in Longlin goat. The results showed that the coding region of ACSS2 of Longlin goat is 2 103 bp, comprised of 18 exons, coding 701 amino acids. The similarity of RNA sequence and protein sequence between Longlin goat and bovine, human, sheep, mouse are 97.9%, 91.5%, 97.6%, 88.2% and 98.4%, 93.6%, 97.4% and 91.9% respectively. The protein sequence of sheep ACSS2 is longer than other species including goat et al by 13 amino acids. The tertiary structure of goat showed high similarity with bovine, human and mouse, and has close genetic relationship with ovis and bovine, but a far distance with pig.

Key words:Longlin goat; ACSS2; intramuscular fat

[中图分类号]S811.6

[文献标识码]A

[文章编号]1005-5228(2015)11-0012-05

*[通讯作者]周恒(1975-)，男，广西桂林人，助理研究员，本科，研究方向为山羊的遗传育种。E-mail：zhouheng9@Sohu.com

[作者简介]曹艳红(1983-)，女，山西灵石人，畜牧师，硕士，研究方向为山羊的遗传育种改良。E-mail：caoyh610@163.com

[基金项目]广西家畜遗传改良重点实验室开放课题(2014GXKLLGI-10)

*[收稿日期]2015-06-03修回日期：2015-07-02