湖羊和徐淮山羊CaSR基因组织表达水平的初步分析

楚素芳，金晶，张吉顺，张春雷，王艳红，房兴堂*

(江苏师范大学 生命科学学院，江苏 徐州 221116)

[摘要]为分析钙敏感受体(CaSR)基因对湖羊和徐淮山羊消化吸收的作用，以6个月龄的湖羊和徐淮山羊为试验材料，利用荧光定量PCR SYBR Green Ⅱ 荧光染料法，对湖羊和徐淮山羊瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠10个组织中CaSR基因的表达水平进行相对定量分析。结果表明：在湖羊的样品组织中，CaSR基因在十二指肠中表达量最高，其次是回肠，两者的表达量差异达到显著水平(P<0.05)；CaSR基因在瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、空肠、盲肠、结肠、直肠中的表达量显著低于在十二指肠及回肠中的表达量(P<0.05)。在徐淮山羊的组织样中，CaSR基因在回肠中的表达量最高，其次是十二指肠，且二者差异显著(P<0.05)；另外，该基因在回肠和十二指肠的表达量显著高于在瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、空肠、直肠中的表达量(P<0.05)，盲肠和结肠中该基因的表达量最低。通过试验说明CaSR在不同组织里的表达具有特异性，在不同的物种间主要表达组织也不同，表明湖羊和徐淮山羊具有不同的消化吸收方式。

[关键词]湖羊；徐淮山羊；CaSR基因；mRNA表达量；荧光定量PCR

20世纪末，世界养羊业产品结构逐渐发生变化，由毛用转向肉用或肉毛兼用，而在肉用方面也由生产大羊肉转向生产小羊肉。随着人们生活水平的提高，对羊肉需求量逐年增加，对羊肉的口感及质量也提出更高的要求，提高肉羊的生产性能和改善肉质成为肉羊产业发展的主要方向。钙敏感受体(Calcium-sensingReceptor，CaSR)属G蛋白偶联受体家族，表达于哺乳动物的大多数组织中，如甲状旁腺、骨骼、乳腺、肾脏、胃、肠道等[1-5]，对维持机体Ca2+稳态起重要作用[6]，还可调节细胞生长、分化和凋亡[7-8]。Tfelt-Hanse等[9]研究发现，在培养的新生大鼠心室肌细胞中有CaSR功能性表达。Molostvov等[10]证明，CaSR在慢性肾脏疾病患者发生的血管钙化中发挥关键作用。最新研究表明，激活CaSR的氨基酸能显著刺激胃酸的产生[11]。另有研究证实，激活CaSR的氨基酸能调控激素的分泌，而这些激素对钙代谢的调控、生长发育、肠对营养物质的消化和吸收等方面都发挥着重要作用[12]。景坤玉等[13]研究发现，CaSR基因启动子区甲基化状态与食管鳞状细胞癌有关。这些结果都表明，CaSR基因在动物胃肠道中表达，可以促进消化，使得水、常量营养素和微量营养素得以吸收。为进一步探讨CaSR基因在家畜胃肠道中表达情况及其功能，本研究以湖羊和徐淮山羊的胃肠组织为试验材料，分析CaSR基因在湖羊和徐淮山羊消化道不同部位mRNA的表达模式与规律，探讨CaSR基因对湖羊和徐淮山羊的肠胃吸收消化功能的影响，为研究CaSR基因功能和营养的吸收调控机制、动物的饲料配比提供有效的理论支持。

1材料与方法

1.1　试验材料的采集

采集6月龄湖羊和徐淮山羊(各3只)的整个消化系统，包括瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠10个组织，用预冷的无菌生理盐水洗去胃肠道残留物和血液，锡箔纸包好后，立即放入液氮中速冻，后转移至 -80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2　主要试剂和仪器

Trizol总RNA提取试剂盒购于北京天根生物科技有限公司，PrimeScript○RRT reagent KIT (perfect Real Time)试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司；微量紫外分光光度计(NANODROP 2000C，基因有限公司)，实时荧光定量PCR仪(step one，美国AB)，凝胶成像仪(BIO-RAD CelDoc EQ，美国)，PCR仪(MJ Research PTC-200，美国)。

1.3　引物设计与合成

参照GenBank中已公布的羊CaSR(GenBank登记号： XM-004002971.1)和β-actin基因(GenBank 登记号：NM-001009784.1)的mRNA序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物，引物由上海生物工程公司合成，引物信息见表1。

表1　CaSR、β-actin 基因PCR引物序列及扩增条件

1.4　RNA提取和反转录

取组织块0.5 mg在液氮预冷的研钵中研磨，按照E.Z.N.ATM Total RNA KitⅠ试剂盒操作说明提取组织总RNA，总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，超微量紫外可见分光光度计测定总RNA浓度和纯度。按照PrimeScript○RRT reagent KIT操作说明对总RNA进行反转录。

1.4.1总RNA中基因组DNA的去除1 μg总RNA，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL gDNA Eraser，RNase Free dH2O补加至10 μL，冰上操作并混匀，随后42 ℃水浴2 min。

1.4.2cDNA的合成在上述反应液中加入1 μL Prime Script RT Enzyme MixⅠ，1 μL RT Prime Mix，4 μL 5×Prime Script Buffer 2(for real time)，4 μL RNase Free dH2O，总体积为20 μL。混合后37 ℃反应15 min，85 ℃灭活5 s，4 ℃温育10 s。RT产物保存于-20 ℃备用。

1.5　引物特异性鉴定与目的基因克隆

分别以湖羊和徐淮山羊十二指肠组织cDNA为模板，进行普通PCR反应，观察条带是否单一来初步判断引物特异性。扩增体系为20 μL，2×Taq Master Mix 10.0 μL，dH2O 7.0 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA1 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环，72 ℃延伸10 min。取PCR产物，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，用SanPrep柱式胶回收试剂盒回收纯化目的片段并进行目的片段的克隆。PCR反应体系：1 μL模板，7.6 μL 2×Reaction Mix，上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL。反应程序为：95 ℃预变性6 min,94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，33个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性菌落用于质粒提取，送上海生工生物有限公司测序。

1.6　荧光定量PCR

以湖羊和徐淮山羊胃肠道各10个组织样本cDNA为模板，用CaSR基因特异性引物进行实时荧光定量PCR。根据扩增产物的熔解曲线是否单一来检测引物的特异性。荧光定量PCR反应总体系为20 μL：0.4 μL ROX Reference Dye，2 μL cDNA，10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ，上下游引物各0.8 μL。反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火温度1 min，40个循环，然后对熔解曲线进行分析。每个样品进行3次平行试验，计算平均值。每批次试验中设阴性对照，并记录各样品的Ct值。

1.7　统计分析

组织样品设置相同的阈值线，β-actin作内参基因进行标准化，用JMP 4.0计算重复样品间Ct均值以及标准偏差，采用2-△△Ct方法处理数据，分析基因在各组织间的相对表达差异量。用SPSS 11.5软件对湖羊和徐淮山羊不同组织间CaSR基因的差异表达进行显著性分析。

2结果与分析

2.1　湖羊和徐淮山羊组织RNA质量检测结果

总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测，显示清晰的28S和18S条带。经核酸蛋白分析仪检测，OD260/OD280=1.8~2.0，表明RNA具有较好的完整性和较高的纯度，可以进行后续试验。

2.2　CaSR和β-actin基因引物特异性检测

引物特异性检测采用普通PCR判定。结果显示基因扩增片段大小和预测的一致，如图2。CaSR基因扩增片段测序结果与羊CaSR基因(GenBank登记号： XM-004002971.1)同源性为100%，β-actin基因(GenBank登记号：NM-001009784.1)同源性为100%，表明扩增片段无误。

图1　总RNA琼脂糖电泳的检测

图2　CaSR和β-actin基因扩增产物

2.3　CaSR基因在湖羊和徐淮山羊消化道组织中的表达谱

湖羊和徐淮山羊CaSR基因在10种组织中的相对表达量见图3。在湖羊消化系统中，CaSR基因在十二指肠中表达量最高，为29.71。其次是回肠，表达量为26.31。两者的表达量差异达到显著水平(P<0.05)，二者与在瘤胃、瓣胃、结肠中的表达量差异达到显著水平(P<0.05)；而CaSR基因在瘤胃、瓣胃、结肠的表达量间没有显著差异(P>0.05)，与网胃、皱胃、空肠、直肠中的表达量有差异，但不显著(P>0.05)；CaSR基因在盲肠中的表达量最低，仅为0.83。在徐淮山羊的消化系统中，CaSR基因在回肠中的表达量最高，为32.64。其次是十二指肠，表达量为24.42。两者中的表达量差异显著(P<0.05)。在瘤胃、瓣胃中，CaSR基因的表达量显著低于在十二指肠中的表达量(P<0.05)，而在网胃、皱胃、空肠、直肠4个组织中的表达量差异不显著(P>0.05)，在盲肠和结肠中CaSR基因的表达量最低，分别为0.22和0.19。

3讨论

动物的生长发育是一个复杂的生理过程，受到遗传、环境以及营养水平的影响。动物摄取的蛋白质分解成小肽，主要依靠位于肠道刷状缘膜上的寡肽转运器吸收。CaSR通过接受细胞信使-Ca2+浓度的高低来调控生物体内离子的平衡、激素的分泌[14]，以调节动物的生理活动。

图3　湖羊和徐淮山羊消化道各段CaSR基因相对表达量

注：大写字母表示CaSR基因在湖羊不同组织间的差异；小写字母表示CaSR基因在徐淮山羊不同组织间的差异(P<0.05)。

Note: The uppercase letters indicate the differences ofCaSRgene in different tissues of sheep; the lowercase indicate the differences ofCaSRgene in different tissues of goat (P<0.05).

从本研究试验结果看，CaSR基因在湖羊和徐淮山羊的各组织中表达存在差异。CaSR基因在湖羊及徐淮山羊的瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃中都有表达，这与Conigrave[15]和Geibel[16]的研究结果一致，表明CaSR在胃上皮细胞表达，使大量的营养素、微量营养素和水得以吸收。瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃和十二指肠吸收的小肽进入非肠膜系统，而由空肠、回肠、盲肠、结肠吸收的小肽进入肠膜系统，非肠膜系统是反刍动物小肽吸收的主要途径，其吸收的小肽数量远远高于后者。由此推测存在于瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃和十二指肠中的营养识别信号分子量应高于空肠、回肠、盲肠、结肠，这与本试验结果显现的趋势相吻合。

另外，本研究发现CaSR基因在湖羊和徐淮山羊的十二指肠及回肠表达量较高，这与Chakrabarty[17]的结果相似，说明绒毛、小肠和结肠的腺细胞及肠肌层广泛分布CaSR基因，进一步证明CaSR可促进胃泌激素、胆囊收缩素等肠道激素的分泌，与蛋白质的消化、多肽和氨基酸的吸收和机体新陈代谢有关[18-19]，并且对肠的蠕动及结肠细胞的增生、分化有一定的生物学作用[20]。

氨基酸的识别由不同的氨基酸受体特异性决定，胞外的CaSR能够对芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸和极性氨基酸做出反应[21]。本次试验结果表明CaSR基因在十二指肠中的表达量湖羊高，徐淮山羊表达量低，在回肠中徐淮山羊高度表达，湖羊相对较低，推测湖羊和徐淮山羊对CaSR识别的氨基酸吸收的主要场地不同，这可能是由湖羊和徐淮山羊的生长环境、饲料结构不同所致。徐淮山羊适于放牧，对气味不正或已践踏过的饲草不采食，喜欢采食灌木嫩枝条，采食的饲草种类较湖羊更丰富，因此产生的能被回肠吸收的特殊的寡肽量较湖羊中多[22]，致使与之结合的氨基酸受体也多，CaSR基因的表达量随之增加。湖羊多处于圈养，采食人工配制饲料，其中多含有丰富的蛋白质，易于小肠的消化和吸收。尤其是在十二指肠中，它是大部分氨基酸吸收的主要场所，需要更多的受体帮助吸收，因此在湖羊的十二指肠中CaSR基因的表达量较徐淮山羊高。

4结论

CaSR基因在湖羊和徐淮山羊的十二指肠及回肠中高表达，瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃中普遍表达；CaSR基因在湖羊和徐淮山羊的组织间表达存在特异性和差异性。

CaSR基因在胃肠系统对营养物质的吸收消化起到调控作用。

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Tissue Expression Analysis ofCaSRGene in Hu Sheep and Xuhuai Goat

CHU Su-fang, JIN Jing, ZHANG Ji-shun, ZHANG Chun-lei, WANG Yan-hong, FANG Xing-tang*

(CollegeofLifeScience,JiangsuNormalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221116,China)

Abstract:In order to study the role of Calcium-sensing Receptor (CaSR) in digestion and absorption in digestive tract of sheep and goat, the relative expressions of CaSR gene were analyzed by real-time quantitative PCR with SYBR GreenⅡin rumen, reticulum, omasum, abomasum, duodenal, jejunum, ileum, cecum, colonic, rectum, testes of 6-month-old male Hu sheep and Xuhuai goat. The results showed that CaSR gene expression was the highest in the duodenal of Hu sheep. The second is the ileum. The expression difference between duodenal and ileum reached a significant level (P<0.05). And in rumen, reticulum, omasum, abomasum, jejunum, caecum, colonic and rectum, the expression of CaSR gene is significantly lower than that in duodenal and ileum (P<0.05). In the goat tissue samples, CaSR gene expression was the highest in the ileum, significantly higher in the duodenal (P<0.05). Both were markedly higher than the levels of gene expression in rumen, reticulum, omasum, abomasum, jejunum and rectum (P<0.05). The expression of CaSR gene detected in cecum and colonic was extremely low. The results suggested that the expression of CaSR gene in different tissues was of specificity, and it expressed differently in the main expression of tissue between Hu sheep and goat, which indicated that Hu sheep and Xuhuai goat had different digestive absorption method.

Key words:Hu sheep; Xuhuai goat; CaSR gene; mRNA expression; real-time quantitative PCR

[中图分类号]S811.6

[文献标识码]A

[文章编号]1005-5228(2015)11-0017-05

*[通讯作者]房兴堂(1963-)，男，江苏沛县人，教授，硕士生导师，研究方向：动物遗传资源及利用。E-mail：xtfang@163.com

[作者简介]楚素芳(1989-)，女，河南睢县人，硕士研究生，研究方向：动物细胞与分子生物学。E-mail：1273174596@qq.com

[基金项目]江苏省高校科研成果产业化推进工程项目(JHB2012-32)；徐州市科技计划项目(XF12C052，KC14N0061)；江苏高校优势学科建设工程资助项目

*[收稿日期]2015-04-13修回日期：2015-05-28