miR-9在骨肉瘤中的表达及临床相关性探讨

尤建宇，王文军，张宁，刘波，赵宝林*

(吉林大学中日联谊医院 骨科，吉林 长春130033)

骨肉瘤好发于青少年，约占所有恶性骨肿瘤的35%[1].传统治疗方法虽然能有效的提高骨肉瘤患者的术后生存率，但是仍有部分患者发生肺部转移。miRNA是一种长度约为22bp的非编码单链RNA,它与靶基因3’端互补配对，降解或抑制靶基因表达，从而影响肿瘤细胞的生长、凋亡等病理过程[2-4]。已有研究表明miR-9在喉鳞癌、鼻咽癌、卵巢癌等肿瘤细胞中呈低表达水平[5-7]，但它在骨肉瘤的表达与临床病理学关系却鲜有报道。本研究检测了miR-9 在骨肉瘤组织中的表达水平，并分析其表达与临床病理学之间的关系。

1材料与方法

1.1骨肉瘤组织的来源选择2011年9月到2013年6月在吉林大学中日联谊医院的32例骨肉瘤患者。选取标准如下：①临床病理学检查和影像学证实为骨肉瘤；②均为原发于四肢的骨肉瘤，无一例在术前行化学或者放射治疗。切取骨肉瘤组织和癌旁正常组织为实验样本，即刻放入液氮中保存，随后保存于-80℃冰箱。

1.2主要试剂RNA提取所需TRLzol reagent以及电泳所需琼脂糖购自Invitrogen公司、DNA提取试剂盒。qPCR逆转录、SYBR Premix Ex TaqⅡ、引物、SYBR○RPrimeScript○RmiRNA RT-PCR Kit (Perfect Real Time)试剂盒均购自上海吉玛公司。

1.3RNA的提取及逆转录根据TRLzol reagent(Invitrogen)说明书抽提RNA，用紫外分光光度计监测A260/A280比值，并检测RNA的纯度和浓度，使用吉玛试剂盒进行逆转录和qRT-PCR。

1.4miRNA靶基因信息学预测使用Star Base 2.0、DIANA LAB和PicTar进行靶基因预测，分类汇总miRNA-9的潜在靶基因，2以上的网站预测的靶基因认为是其可能靶基因。

1.5qRT-PCR验证表达水平差异较大的miRNA将1 000 ng RNA加入20 μl逆转录反应体系进行逆转录，RT-PCR仪验证差异表达的miRNA和靶基因，U6作为实验内参，GAPDH引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；扩增条件：95℃变性30 s，95℃变性25 s，60℃退火延伸25 s，50个循环。hsa-miR-9引物的序列：5′-TCTTTG GTTATCTAGCTGTATGA-3′。扩增条件：95℃变性30 s，95℃变性20 s，60℃退火延伸30 s，45个循环。SRPK-1引物序列：5′-CACGGCATGCATGGCCTTTGA-3′和5′-CGGCGGCAGTGGCTCTCTTC-3′。

1.6统计学分析使用SPSS17.0统计学软件进行统计学计算。两组计量资料使用非独立样本t检验，使用方差分析多组计量资料,P<0.05为差异具有统计学意义。用Origin7.5软件绘制数据图形。

2结果

2.1miR-9扩增曲线圆滑，为单峰型，显示为特异性扩增。融解曲线的特异性也较好(如图1所示)。

图1　miR-9的扩增曲线及其融解曲线

2.2　miR-9在骨肉瘤和癌旁正常骨组织中的表达水平

miR-9在骨肉瘤和癌旁正常骨组织中均有表达，与癌旁正常骨组织相比，miR-9在骨肉瘤组织的表达水平呈降低趋势(如图2，P<0.05)；

图2　miR-9在骨肉瘤组织和癌旁正常骨组织中的表达水平

2.3　miR-9在骨肉瘤中的表达水平和临床病理学关系

根据 miR-9表达的中位值,骨肉瘤患者被分为两组:低表达组(n=18)和高表达组(n=14)。miR-9与骨肉瘤患者的年龄、性别、肿瘤分型和分期无显著关系(P>0.05)。 (如表1)。

2.4　RT-PCR法检测SRPK-1 mRNA在骨肉瘤组织和癌旁正常骨组织中的表达水平

实验表明SRPK-1 mRNA的表达水平在骨肉瘤组织和癌旁正常骨组织没 有显著差异(如图3,P>0.05)

2.5　双变量相关性分析miR-9和SRPK-1在骨肉瘤中的表达关系

Spearman 双变量相关性分析显示SRPK-1与miR-9呈显著的负相关(r=-0.973,如图4，P<0.05)。

表1　miR-9表达与骨肉瘤患者的年龄、性别、肿瘤分型和

图3　SRPK-1 mRNA在骨肉瘤组织和癌旁正常骨组织中

图4　双变量相关性分析miR-9和SRPK-1在骨肉瘤中的

3讨论

研究表明[8，9]miRNA的表达谱在肿瘤组织和癌旁正常组织之间存在差异表达,然而，不同个体的相同组织间表达水平却趋于一致。所以，比较miRNA在肿瘤实体组织和癌旁组织之间的表达水平差异,可能有助于找到诊断肿瘤的分子标志物[10-11]。

miR-9在多种恶性肿瘤中呈低表达水平，本研究发现miR-9在骨肉瘤组织和癌旁正常组织中存在显著的差异表达，而且miR-9在骨肉瘤组织中呈低表达,与之前研究较一致[4-6]。此外，研究还发现miR-9在原发骨肿瘤中比转移肿瘤具有较高的水平,表明miR-9可能参与骨肉瘤的转移和进展。

本实验首次分析骨肉瘤组织及癌旁正常骨组织中miR-9的表达水平，发现84.4%的骨肉瘤患者组织中miR-9表达下调。说明 miR-9低表达可以作为骨肉瘤的诊断指标；而SRPK-1蛋白与 miR-9表达的负相关则提示SRPK-1可能是miR-9的调控靶点。

参考文献：

[1]Broadhead ML,Clark JC,Myers DE,et al.The molecular pathogenesis of osteosarcoma:a review[J].Sarcoma,2011,2011,20:959.

[2]ZENG Y.Principles of micro-RNA production and maturation[J].Oncogene,2006,25(46):6156.

[3]Volk N,Shomron N.Versatility of microRNA biogenesis[J].PLoS One,2011,6(5):19391.

[4]Sayed D,Abdellatif M.MicroRNAs in development and disease[J].Physiol Rev,2011,91(3):827.

[5]Minor J,Wang X,Zhang F,Methylation of microRNA-9 is a specific and sensitive biomarker for oral and oropharyngeal squamous cellcarcinomas[J].Oral Oncol,2012，48(1):73.

[6]Gao F,Zhao ZL,Zhao WT,miR-9 modulates the expression of interferon-regulated genes and MHC class I molecules in human nasopharyngeal carcinoma cells.Biochem Biophys Res Commun[J].2013，431(3):610.

[7]Hu Y,Correa AM,Hoque A,Prognostic significance of differentially expressed miRNAs in esophageal cancer[J].Int J Cancer,2011,128(1):132.

[8]Novello C,Pazzaglia L,Cingolani C,et al.miRNA expression profile in human osteosarcoma:Role of miR-1 and miR-133b in proliferation and cell cycle control[J].Int J Oncol,2013,42:667.

[9]Jones KB,Salah Z,Del Mare S,et al.miRNA signatures associate with pathogenesis and progression of osteosarcoma[J].Cancer Res,2012,72:1865.

[10]Nikifomva MN，Tseng GC，Steward D，et al．MicroRNA expressionprofiling of thyroid tumors：biological significance and diagnosticutility[J]．J Clin Endocrinol Metab,2008,93(5):1600．

[11]Cho WC.OncomiRs:the discovery and progress of microRNAs incancers[J].Mol Cancer,2007,6:60.

收稿日期：(2014-01-23)

文章编号：1007-4287(2015)01-0027-03

通讯作者*