孙牧男，刘　磊，马寅芙，许淑芬，方艳秋，谭　岩

(吉林省人民医院 中心实验室，吉林 长春130021)

CXCL12/CXCR4在小细胞肺癌患者中的表达及临床意义

孙牧男，刘磊，马寅芙，许淑芬，方艳秋，谭岩*

(吉林省人民医院 中心实验室，吉林 长春130021)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0050)

肺癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤，其中小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)是一种恶性程度较高的肺癌[1,2]，在肺癌中所占的比例约20%-25%。小细胞肺癌恶性程度高，倍增时间短，转移早而广泛，对化疗、放疗敏感，初治缓解率高，但极易发生继发性耐药，容易复发[3,4]。

CXCL12又称基质细胞衍生因子-1(SDF-1)是小分子的细胞因子，属于趋化因子蛋白家族。CXCL12及其受体CXCR4的生理功能主要是介导免疫和炎性反应，近年来研究发现，CXCL12/CXCR4还与多种肿瘤的侵袭和转移密切相关[5,6]。

本研究通过检测SCLC患者手术前外周血中CXCL12含量及组织中CXCL12/CXCR4的表达，探讨了CXCL12/CXCR4与结直肠癌患者临床病理特征之间的关系及其在SCLC进展中的作用。

1材料与方法

1.1　研究对象

收集吉林省人民医院初次住院的SCLC患者62例，其中男性50例、女性12例，年龄42-68岁，平均年龄57岁；局限期(Limited stage disease，LD)患者30例，扩散期(Expensive stage disease，ED)患者32例。所有患者手术前均未接受放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗，术后均获得病理确诊。另外选择10例良性肺部肿瘤患者作为对照组，男性7例、女性3例，年龄35-66岁，平均年龄53岁，均排除各脏器病变，无感染性疾病等。

1.2　标本采集

采用真空干燥采血管分别抽取受检者手术前清晨空腹静脉血10 ml和健康志愿者清晨空腹静脉血10 ml，真空干燥采血管中血样于室温下自然凝集30 min，3 500×g 离心15 min，分离血清，置于-20℃冰箱中保存待检。手术中收集原发性肺癌切除标本，5倍体积RNA later保存于-80℃冰箱。

1.3　试剂和仪器

人基质细胞衍生因子1β(SDF-1β/CXCL12)ELISA试剂盒购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；M-MLV逆转录试剂盒购于Promega公司；实时荧光定量PCR试剂盒购于宝生物工程有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术公司；RNA later保存液购于美国安捷伦公司；鼠抗人CXCL12、CXCR4抗体及兔抗鼠二抗均购于Sant Cruz公司。

1.4　方法

1.4.1ELISA 方法检测SCLC患者血清CXCL12水平，严格按照CXCL12检测试剂盒说明书提供的方法，向96孔板中分别加入CXCL12抗体，密封4℃过夜，次日用洗涤缓冲液洗涤3次，封闭液封闭后向孔板中先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl，室温下孵育后用CXCL12抗体检测，洗涤后加入酶标试剂50 μl，室温下孵育45 min，洗涤后加入显色液，避光显色15 min，加终止液后测定A450值。同时收集10名健康人血清作为对照。

1.4.2RT-PCR和Westernblot方法检测CXCL12/CXCR4表达水平 TRIZOL法提取组织中RNA，用M-MLV逆转录酶进行逆转录，PCR扩增CXCL12和CXCR4，同时扩增GAPDH作为内参物。CXCL12引物序列为：上游引物5’-CCGCGCTCTGCCTCAGCGACGGGAAG-3’,下游引物5’-CTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGTACT-3’；CXCR4引物序列为：上游引物5’-AGCTGTTGGTGAAAAGGTGGTCTATG-3’,下游引物5’-GCGCTTCTGGTGGCCCTTGGAGTGTG-3’；GAPDH引物序列为：上游引物5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’,下游引物5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。将同样大小肺癌组织及良性对照组织匀浆，细胞裂解液冰上裂解30 min，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以每孔80 μg蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳、转膜，用CXCL12、CXCR4一抗4℃孵育过夜，加入相应的辣根过氧化物没标记的二抗室温孵育1 h，DAB显色。

1.5　统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件对结果进行分析，所有检测结果均以 Mean ± SD表示，P<0.05 为差异有统计学意义。

2结果

2.1SCLC患者血清CXCL12水平的变化ELISA检测结果显示，62例SCLC患者血清中CXCL12水平均明显高于健康对照组，同时扩散期患者血清中CXCL12含量也高于局限期患者血清中的含量。差异具有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1采用酶联免疫吸附试验检测不同分期SCLC患者和健康对照组血清中CXCL12的含量

2.2ELISA检测血清中CXCL12与SCLC患者病理特征的关系 实验结果显示，CXCL12的表达水平与肿瘤大小及淋巴结转移密切相关(P<0.01)，与患者年龄和性别之间的关系无统计学意义(P>0.05)，见表1)。

表1　SCLC患者及正常对照组临床资料分析

*：与对照组相比具有统计学差异，P<0.01。△：SCLC组内相比具有统计学差异，P<0.01。

2.3SCLC患者组织中CXCL12和CXCR4表达水平Real-time PCR和Westernblot结果显示，62例SCLC患者肺癌组织中CXCL12和CXCR4在转录水平和表达水平均明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图2。

图2采用Real-time PCR和Westernblot方法分别检测不同分期SCLC患者和对照组组织中CXCL12、CXCR4的表达水平。

3讨论

CXCL12 基因定位于人 10 号染色体长臂，能与CXCR4的N端特异性结合，并与CXCR4结合后形成CXCL12/CXCR4生物轴，进而启动下游信号通路，在维持胚胎发育、介导免疫及炎症反应、调控造血、诱导血管生成、肿瘤侵袭转移等多种生理病理过程中发挥重要作用[7,8]。大量研究表明，CXCL12与CXCR4结合可以调节多种肿瘤细胞增殖，包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤、膀胱癌、食管癌、结直肠癌以及尤文肉瘤等[9- 16]。

本研究检测了SCLC患者血清和组织中CXCL12/CXCR4的表达水平，结果显示，与对照组比较，SCLC患者血清中CXCL12水平明显上升，并且扩散期SCLC患者与局限期SCLC患者相比具有更高水平的CXCL12。同时，患者血清中CXCL12的表达还与肿瘤的大小及淋巴结转移明显相关，这表明，CXCL12/CXCR4可能直接参与了SCLC的发生、转移和侵袭，加剧了肿瘤的病理进展，这可能与CXCL12/CXCR4相关的信号通路相关。

CXCL12/CXCR4通路介导肿瘤细胞增殖是通过多种信号传导实现的。CXCL12/CXCR4可以改变G蛋白的化学结构，进而激活应激活化蛋白激酶/JNK信号通路(stress activated protein kinase/Jun-N terminal kinases，SAPK/JNK)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated kinase 1/2，ERK1/2)通路[17-19]。Carmo等[20]发现CXCL12/CXCR4可以活化PI3K/Akt信号通路诱导胶质瘤细胞的增殖和转移，再者，CXCL12可以通过自分泌和旁分泌方式诱导肿瘤细胞增殖[22]。因此CXCL12/CXCR4表达失调会导致某些自主细胞增殖和细胞恶性转化，这可能介导了肺癌的恶性发展。

随着对CXCL12及其他趋化因子家族的不断研究，其在多种免疫病以及肿瘤中的作用得到越来越广泛的认可。本研究提示CXCL12可以作为提示小细胞肺癌进程的重要分子标记，但是其调节作用的具体机制还需进一步探讨。

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摘要：目的研究小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)患者外周血中CXCL12及其受体CXCR4的表达情况，探讨CXCL12/CXCR4与SCLC发生和发展之间的关系。方法采用ELISA、real-time PCR和Westernblot方法，检测CXCL12与CXCR4在30例局限期(Limited stage disease，LD)SCLC患者、32例扩散期(Expensive stage disease，ED)SCLC患者和10例良性肺部肿瘤患者(对照组，Control)中的转录水平和表达水平，分析CXCL12、CXCR4与SCLC患者临床病理等指标之间的关系。结果CXCL12、CXCR4在SCLC患者组织中均高表达，其中扩散期患者CXCL12、CXCR4表达平略高于局限期患者组。扩散期患者外周血中CXCL12表达高于其在局限期患者中的水平，二者均高于对照组。血清中CXCL12水平与患者的性别和年龄无关(P>0.05)，而与肿瘤的大小及淋巴结转移明显相关(P<0.01)。结论CXCL12/CXCR4可能直接或间接参与对SCLC发生和发展的调控。

关键词：肺癌；CXCL12；CXCR4

Expression of CXCL12/CXCR4 cells in small cell lung cancer and their clinical significanceSUNMu-nan,LIULei,MAYin-fu,etal.(CentralLaboratory,thePeople’sHospitalofJilinProvince,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo study the expression levels of CXCL12 and CXCR4 in patients with small cell lung cancer (SCLC),and to investigate the correlation between CXCL12/CXCR4 and the development of human SCLC.MethodsThe serum concentration of CXCL12 was detected by ELISA,and the expression of CXCL12/CXCR4 in tissues were detected by real-time PCR and Westernblot respectively in 30 SCLC patients in limited stage,32 SCLC patients in extensive stage and 10 benign lung cancers (control).Then we analyzed the correlation between CXCL12/CXCR4 and clinical pathological characteristics of SCLC.ResultsThe concentration of serum CXCL12 was higher in patients with limited stage than that in patients with extensive stage,both of them were showed a higher level than that in HC.The expressions of CXCL12/CXCR4 were also higher in SCLC patients than that in HC as well.The serum level of CXCL12 was associated with tumor size and lymphatic metastasis (P<0.01) and had no relations with sex or age of patients (P>0.05).ConclusionThe expression of CXCL12/CXCR4 may participate in regulating the development of SCLC.

Key words:small cell lung cancer; CXCL12; CXCR4

收稿日期：(2013-12-26)

作者简介：孙牧男(1983-)，女，硕士研究生，技师，主要研究方向为肿瘤生物学治疗。

文献标识码：A

中图分类号：R734.2

文章编号：1007-4287(2015)01-0050-04

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