许建婷，金浩范，王冀邯，牛　超，高长曌，王国庆，李　凡*

(1.吉林大学基础医学院，吉林 长春130021；2.吉林大学第一医院 肿瘤中心，吉林 长春130021)

基于分子互作网络的MMPs相关基因在胃癌组织中的表达研究

许建婷1,2，金浩范2，王冀邯1，牛超2，高长曌1，王国庆1，李凡1*

(1.吉林大学基础医学院，吉林 长春130021；2.吉林大学第一医院 肿瘤中心，吉林 长春130021)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0056)

胃癌作为临床常见的消化道恶性肿瘤，多年来困扰着我国的国民健康[1]。早期检出率低是胃癌死亡率居高不下的关键原因，往往被诊断出中晚期的病例已伴随着癌细胞的广泛侵袭及远处转移，直接否决了手术根治的可能性[2]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族因其能够降解细胞基底膜和基质、突破细胞外基质屏障，被认为与细胞的侵袭、扩散、转移等过程直接相关[3]。已有研究显示胃癌中部分MMPs家族成员表达异常，然而单个甚至数个分子并不能系统的诠释胃癌的发展机制。作为酶类蛋白质，MMPs往往通过与其相关基因、蛋白相互作用，共同参与疾病的发生发展。因此全面的基因筛查及分子间相互作用网络的探索对解释疾病的发生发展至关重要。本研究以胃癌组织高通量芯片为信息基础，整合BioGRID[4]数据库信息，构建了胃癌组织中MMPs家族相关的分子互作网络，旨在为胃癌的侵袭、转移研究提供更多的分子学机制。

1材料与方法

1.1　标本采集

研究选取2012年5月至2013年5月吉林大学附属第一医院胃肠外科收治入院、经病理检测确诊为胃癌的患者10例，术前未行放化疗措施。年龄48-71岁，平均年龄57.6岁，男性6例，女性4例。分别选取癌症病灶组织及相应距病灶>5 cm以上的癌旁组织(视为正常对照组)，所有标本均在术后10 min内置于液氮冻存。

1.2　组织总RNA提取及芯片实验

运用Trizol法(Invitrogen,USA)提取组织总RNA。用紫外分光管度计(NanoDrop,USA)检测总RNA浓度及纯度，甲醛变性凝胶电泳检测所提取RNA的完整性，选取符合OD260/OD280值在1.8-2.0之间、条带完整的RNA样本进行芯片实验。调整RNA样本浓度至1 μg/μl进行逆转录，进而进行生物素标记cRNA的合成、纯化、片段化，以1μl体积的片段化cRNA进行芯片杂交过程。运用GCOS(GeneChip○ROperating Software)软件进行芯片扫描，基因芯片显著性分析(Significant Analysis of Microarray,SAM)法筛选胃癌组织的差异表达基因[5]，筛选改变倍数(fold change,FC)>2,P<0.05为差异基因。实验过程中所用试剂、仪器均来自Affymetrix(Affymetrix,USA)公司。

1.3　蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络的构建及功能注释

以胃癌中差异表达基因为研究基础，选取Biological General Repository for Interaction Datasets (BioGRID)在线工具获取蛋白质-蛋白质相互作用关系。筛选的设定：软件物种来源限定为Homo sapiens，检索渠道by gene。运用DAVID数据库[6]进行GO及Pathway注释。

2结果

2.1　组织总RNA提取及芯片扫描初始结果

运用Trizol法提取组织总RNA，经紫外分光光度计测得RNA样本A260/A280比值在1.8-2.0之间，甲醛变性凝胶电泳检测RNA条带完整，如图1所示。将浓度、纯度及完整性良好的RNA样本进行芯片杂交、扫描，所得扫描初始图如2所示。

2.2　胃癌组织差异基因的表达分析

N：癌旁组织，C：癌症组织

N：癌旁组织，C：癌症组织

芯片扫描共得到1666个差异基因(fold change>2，P<0.05)，其中1540个在胃癌组织中呈高表达，126个呈低表达。结果显示MMP家族多个成员在胃癌组织中均呈高表达状态，详细的基因差异表达倍数改变见表1。

2.3　MMPs及其相关分子互作网络的构建与功能分析

将BioGRID数据库中分子互作关系与基因芯片结果整合，得到胃癌组织中表达失调的MMPs相关分子互作网络，如图3所示，网络中18基因在胃癌组织中表达活跃(表1所示)。此18个基因参与了重要的生物学过程(GO-BP)及调控通路(Pathway)，如图4所示。其中富集程度最显著的GO条目是细胞外基质的分解、细胞外组分分解等生物过程，富集程度最显著的Pathway条目是ECM-受体的相互作用、黏着斑等通路，以上的生物过程及通路也是与癌症的侵袭、转移过程密切相关的[7,8]。

BioGRID中MMPs相关的蛋白质相互作用网络图。红色圆圈为胃癌组织中高表达基因(P<0.05)

图3胃癌组织中失调的MMPs家族蛋白质-蛋白质

相互作用网络

A:GO富集; B:Pathway富集。横坐标为条目显著性p-value的-log2值，纵坐标为GO及Pathway条目名称。

GenesFoldChangeLog2FCMMP17.112.83MMP103.501.81MMP124.172.06MMP132.031.02MMP142.641.40MMP22.231.16MMP37.782.96MMP74.922.30ITGA23.031.60LUM4.762.25COL1A14.662.22LCN22.691.43OSBPL102.081.06TGFB12.061.04THBS24.502.17TIMP14.472.16BRCA13.691.43CD442.061.04

Fold Change为基因的差异改变倍数，Log2FC为Fold Change(FC)的log2值。

3讨论

细胞外基质是细胞侵袭、转移的重要屏障成分，基质金属蛋白酶家族MMPs可以降解细胞基底膜及外基质中蛋白组分，因此促进了恶性肿瘤的浸润、转移过程。相关研究报道了MMP1[9],MMP2[10],MMP7[11],MMP11[12]等多个MMPs成员在胃癌及其它癌症中表达上调。我们通过组织基因扫描发现MMPs多个基因在胃癌组织中呈高表达状态，其中MMP3及MMP1上调最为明显(表1)。

分子相互作用网络分析有助于为疾病的发生发展提供较为系统的分子学机制。BioGRID数据库提供了已发表文献证实的和预测的蛋白质相互作用关系，将数据库中的蛋白互作信息与前期基因芯片的差异表达相结合，得到胃癌组织中存在差异表达的MMPs相关的蛋白互作网络，网络中18个分子在胃癌组织中呈高表达状态，且其参与的主要的分子功能及通路和癌症的侵袭、转移过程密切相关，体现了MMPs及相关基因在胃癌发生发展中的重要性。

随着技术的不断发展，高通量组学数据及相应的在线软件、分析工具等为生物医学提供了广泛的信息筛选平台[13]。通过对所选基因的功能及通路注释，往往能够得到与疾病的发生发展密切相关的分子学机制，这些信息有助于我们更好的理解已知的基因或者蛋白的作用，也能够指导研究者寻找出更多未知功能的潜在分子靶标。本文在以上研究思路的指引下，获得了与胃癌侵袭、转移过程密切相关的MMPs参与的分子互作网络，为后续研究提供了较为全面的分子学机制基础。

参考文献：

[1] Wang J,Ni Z,Duan Z,et al.Altered Expression of Hypoxia-Inducible Factor-1a(HIF-1a) and Its Regulatory Genes in Gastric Cancer Tissues[J].PLoS ONE,2014,9(6):e99835.

[2]Piazuelo MB,Correa P.Gastric cancer:Overview[J].Colomb Med (Cali).2013,44(3):192.

[3]Chenchao Ma,Bo Wu,Xinyu Huang,et al.SUMO-specific protease 1 regulates pancreatic cancer cell proliferation and invasion by targeting MMP-9[J].Tumor Biol,2014.DOI 10.1007/s13277-014-2598-1.

[4]Andrew Chatr-aryamontri,Bobby-Joe Breitkreutz,SvenHeinicke,et al.The BioGRID interaction database:2013 update[J].Nucleic Acids Research,2013(41),Database issue:D816.

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[6]Huang da W,Sherman BT,Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J].Nat Protoc,2009,4:44.

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[8]Ding D,Lou X,Hua D,et al.Recurrent targeted genes of hepatitis B virus in the liver cancer genomes identified by a next-generation sequencing-based approach[J].PLoS Genet,2012,8(12):e1003065.

[9]Fang WL,Liang WB,Gao LB,et al.Genetic polymorphisms in Matrix Metalloproteinases -1 and -7 and susceptibility to gastric cancer:an association study and meta-analysis[J].Iran J Allergy Asthma Immunol,2013,12(3):203.

[11]Blanco-Calvo M,Tarrío N,Reboredo M,Haz-Conde M,et al.Circulating levels of GDF15,MMP7 and miR-200c as a poor prognostic signature in gastric cancer[J].Future Oncol,2014,10(7):1187.

[12]Kou YB,Zhang SY,Zhao BL,et al.Knockdown of MMP11 inhibits proliferation and invasion of gastric cancer cells[J].Int J Immunopathol Pharmacol,2013,26(2):361.

[13]Ding L,Wendl MC,McMichael JF,et al.Expanding the computational toolbox for mining cancer genomes[J].Nat Rev Genet,2014,15(8):556.

摘要：目的探讨MMPs相关分子互作网络在胃癌组织中的表达情况。方法运用10对胃癌及相应癌旁组织芯片筛选胃癌组织中差异表达基因，结合BioGRID数据库，构建胃癌组织中表达异常的MMPs相关分子互作网络。结果胃癌中多个MMPs家族成员及其互作网络中的18个基因均呈高表达状态，主要参与的生物学过程及通路和癌症细胞的侵袭、转移等过程密切相关。结论高通量组学及相关数据库、分析工具的结合有助于构建癌症中表达异常的分子互作网络，为后续的研究提供较全面的分子学机制基础。

关键词：分子互作网络；MMPs；BioGRID数据库；GO；Pathway

Expression analysis of MMPs and their related genes based on the molecular interaction network in gastric cancer tissuesXUJian-ting,JINHao-fan,WANGJi-han,etal.(CollegeofBasicMedicalSciences,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression of MMPs-related molecular interaction network in gastric cancer tissues.Methods10 pairs of gastric cancer and their corresponding para-carcinoma tissues were analyzed with microarray for screening of the differentially expressed genes,then constructed the differentially expressed MMPs-related molecular interaction network in gastric cancer tissues by integrating the information from BioGRID databases and the microarray results.Results18 genes in the MMPs-related molecular interaction network (also including several MMPs members) were up-regulated in gastric cancer tissues,the main biological processes and pathways that they participated in were closely related with cancer invasion and metastasis progression.ConclusionThe combination of high-throughput genomics,bioinformatic databases and analytical tools is necessary for the analysis of cancer-related molecular interaction network,which will provide more comprehensive molecular mechanisms for the future research.

Key words:molecular interaction network;MMPs;BioGRID;GO;Pathway

收稿日期：(2013-12-11)

文献标识码：A

中图分类号：R735.2

文章编号：1007-4287(2015)01-0056-04

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