左丽云，赵　淳，乐　薇，吉瑞冬，孙　雯，吴士筠

(武汉工商学院，湖北 武汉 430065)



响应面法优化箬叶总黄酮的大孔树脂纯化工艺

左丽云，赵淳，乐薇，吉瑞冬，孙雯，吴士筠

(武汉工商学院，湖北 武汉 430065)

摘要：采用大孔树脂纯化箬叶总黄酮。由静态吸附与解吸实验筛选出最佳树脂，在动态吸附与解吸单因素实验的基础上，运用响应面法实验优化箬叶总黄酮的大孔树脂纯化工艺条件。结果表明：HPD-800树脂对箬叶总黄酮的吸附容量最大，上样液pH值为9，上样液浓度为2.3 mg·mL-1，上样流速为1.0 mL·min-1,用4 BV 80%乙醇以3 BV·h-1速度洗脱，解吸率为84.62%。

关键词：箬叶；总黄酮；纯化；大孔树脂；响应面法

箬叶是禾本科竹亚科箬竹属植物叶的总称，它含有多种生物活性成分，如黄酮、活性多糖、维生素、微量元素、挥发油、芳香成分、茶多酚等[1-2]。箬叶总黄酮有很好的清除体内自由基[3]、抗氧化和衰老、提高免疫力、抗菌、抗病毒[4]等作用。从植物体中提取高纯度的天然黄酮类物质引起了研究者的广泛关注，已成为药物研发与利用的热点[5]。大孔树脂是一种吸附能力很强的吸附剂，具有吸附选择性好、热稳定性好、再生处理简便等优点[6-7]，尤其适合黄酮类化合物的纯化[8-10]。作者在此采用大孔树脂纯化箬叶总黄酮，并通过响应面法实验优化工艺条件，拟为箬叶的进一步开发提供参考。

1实验

1.1　材料、试剂与仪器

箬叶，采集于湖北宜昌长阳土家族自治县，洗净晾干后储藏备用；大孔树脂AB-8、D-101、D-301、HPD-600、HPD-800，华南理工大学振华有限公司。

无水乙醇、石油醚，国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠，天津风船化学试剂科技有限公司；硝酸铝、亚硝酸钠，天津天力化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。

BSZ-160型自动部分收集器，上海沪粤明科学仪器有限公司；RE52CS型旋转蒸发器，上海五久自动化设备有限公司；752型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司。

1.2　方法

1.2.1大孔树脂预处理

大孔树脂预处理参照文献[11]进行。

1.2.2箬叶总黄酮提取液的制备

取一定量的箬叶粉碎后置于石油醚中浸泡24 h，去色素。以70%乙醇为提取剂，按料液比1∶20(g∶mL，下同)于60 ℃提取 2 h，抽滤，浓缩至无沉淀，即得箬叶总黄酮提取液。

1.2.3箬叶总黄酮浓度的测定

准确称取芦丁标准品15 mg溶于30%乙醇中，并定容至100 mL。用移液管分别取芦丁标准品溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL于10 mL容量瓶中；加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，混匀，静置6 min；再加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；再加入4%氢氧化钠溶液4 mL，以30%乙醇定容至刻度，摇匀，静置10 min；测定510 nm处吸光度，参比为不加芦丁标准品的溶液。以吸光度(A)为纵坐标、芦丁标准品浓度(c)为横坐标绘制标准曲线。

准确移取1.00 mL箬叶总黄酮提取液于10 mL容量瓶中，按上述方法加入各种试剂，以不加箬叶总黄酮提取液的溶液为参比，测定510 nm处吸光度。依标准曲线计算箬叶总黄酮浓度。

1.2.4大孔树脂纯化工艺条件的优化

1.2.4.1大孔树脂静态吸附与解吸

(1)静态吸附实验

称取预处理过的5种树脂各1.00 g，加入一定浓度的箬叶总黄酮提取液，待吸附饱和后，测定剩余溶液中总黄酮浓度，按式(1)计算树脂的静态吸附容量(mg·g-1):

(1)

(2)静态解吸实验

将吸附饱和的树脂用蒸馏水洗至流出液无色,滤纸吸干树脂表面残留液，加入20 mL 90%乙醇溶液，置于25 ℃、60 r·min-1摇床中解吸20 h，滤出树脂，测定解吸液中总黄酮浓度，按式(2)计算静态解吸率:

(2)

1.2.4.2大孔树脂动态吸附与解吸

(1)动态吸附实验

将预处理好的HPD-800树脂装入层析柱中，柱床体积为16 mL，将箬叶总黄酮提取液以1.0 mL·min-1的流速上样，每3 mL收集流出液，测定总黄酮浓度。找出泄漏液总黄酮浓度为上样液浓度的1/10的泄漏液体积[12],按式(3)计算树脂的动态吸附容量(mg·g-1)：

(3)

(2)动态解吸实验

将上述吸附饱和的树脂用蒸馏水洗至流出液无色，用不同体积分数的乙醇以不同流速洗脱，每3 mL收集洗脱液，测定总黄酮浓度，按式(4)计算动态解吸率：

(4)

1.2.4.3响应面法实验

在静态吸附与解吸实验确定最佳树脂、动态吸附与解吸单因素实验的基础上，采用响应面法实验优化箬叶总黄酮纯化工艺。

2结果与讨论

2.1　大孔树脂的筛选

比较了5种树脂(AB-8、D-101、D-301、HPD-600、HPD-800)对箬叶总黄酮的静态吸附容量与静态解吸率，结果见图1。

从图1可看出，5种树脂都可以吸附箬叶总黄酮，其中HPD-800的静态吸附容量最大，静态解吸率也相对较高。因此，选择HPD-800树脂纯化箬叶总黄酮。

2.2　上样液pH值的确定

由于箬叶总黄酮在酸性和中性条件下溶解度较小，故仅考察其在碱性条件下的影响。比较了上样液pH值分别为7、8、9、10、11、12时的静态吸附容量，结果见图2。

图1　5种树脂的静态吸附容量(a)和静态解吸率(b)Fig.1　Static adsorption capacity(a) and static desorption rate(b) of five kinds of resin

图2　不同pH值下的静态吸附容量Fig.2　Static adsorption capacity underdifferent pH values

从图2可看出，上样液pH值为9时的静态吸附容量最大。因此，选择上样液pH值为9。

2.3　动态吸附与解吸条件的确定

2.3.1上样液浓度

取2 BV、pH值为9的不同浓度的箬叶总黄酮提取液通过HPD-800树脂床，测定动态吸附容量，结果见图3。

从图3可看出，随着上样液(箬叶总黄酮提取液)浓度的增大，树脂动态吸附容量逐渐增大。由于箬叶总黄酮提取液浓缩至2.3 mg·mL-1后再进一步浓缩有沉淀析出，故选择上样液浓度为2.3 mg·mL-1。

2.3.2上样流速

图3　不同上样液浓度下的动态吸附容量Fig.3　Dynamic adsorption capacity at differentconcentrations of sample solution

取2 BV、pH值为9、浓度为2.3 mg·mL-1的箬叶总黄酮提取液以不同流速通过HPD-800树脂床，绘制泄漏曲线，测定动态吸附容量，结果见图4。

图4　不同上样流速下的泄漏曲线(a)和动态吸附容量(b)Fig.4　Leakage curves(a) and dynamic adsorption capacity(b) at different flow rates

从图4可看出，随着上样流速的加快，动态吸附容量逐渐减小。这是因为，流速过快，树脂还没有充分吸附，箬叶总黄酮就已经随流出液流出。流速为0.5 mL·min-1和1.0 mL·min-1时的动态吸附容量差别不大，考虑到流速慢耗时不经济，所以选择上样流速为1.0 mL·min-1。

2.3.3洗脱剂体积分数

箬叶总黄酮难溶于水，易溶于乙醇等弱极性溶剂，故选择乙醇作为洗脱剂。用不同体积分数(30%、50%、70%、90%、100%)的乙醇水溶液分别进行洗脱，洗脱效果见表1。

表1　不同乙醇体积分数下的解吸率Tab.1　Desorption rate of different volume fractions of ethanol

从表1可知，随着乙醇体积分数的增大，动态解吸率先升高后降低，在乙醇体积分数为70%时，解吸率达到最高。因此，选择洗脱剂乙醇体积分数为70%。

2.3.4洗脱流速

用70%乙醇水溶液以不同流速洗脱pH值为9的箬叶总黄酮提取液，测定洗脱液中总黄酮浓度，绘制洗脱曲线，结果见图5。

图5　不同洗脱流速下的洗脱曲线Fig.5　Elution curves at different elution flow rates

从图5可看出，洗脱流速对总黄酮浓度的影响较大，流速越慢，洗脱峰拖尾越不明显。考虑到经济性与时效性，选择洗脱流速为3 BV·h-1，此时洗脱效果好，洗脱剂用量少。

2.4　响应面法实验优化箬叶总黄酮纯化工艺

2.4.1响应面法实验结果与分析

在单因素实验的基础上，选取洗脱剂体积分数、洗脱流速、洗脱剂用量3个因素的3个水平进行响应面法实验，优化箬叶总黄酮纯化工艺。响应面法实验的因素与水平见表2，结果与分析见表3，方差分析见表4。

表2　响应面法实验的因素与水平Tab.2　Factors and levels of response surface methodology

运用Design Expert 8.0.6.1软件对表3数据进行统计分析，可得出3个因素和解吸率之间的回归关系式：解吸率=-117.28237+2.37789A+17.10325B+39.80475C+0.10413AB-0.15325AC+2.68750BC-0.012793A2-6.18950B2-4.27200C2。

从表4可知，该方程P<0.01，表明响应回归模型显著，均方差R2=0.9292，表明 92.92% 的数据可以用此方程来解释。所以可以用此方程来分析和预测大孔树脂纯化箬叶总黄酮的工艺条件。

表4　方差分析Tab.4　Variance analysis

2.4.2响应曲面和等高线

解吸率对应于洗脱剂体积分数、洗脱流速、洗脱剂用量所形成的三维空间曲面图以及在二维平面上的等高线图可直观反映洗脱剂体积分数、洗脱流速、洗脱剂用量以及它们之间的交互作用对解吸率的影响[13-14]。

利用Design Expert 8.0.6.1软件分析得到的响应曲面和等高线如图6所示。

图6　响应曲面和等高线图Fig.6　Response surface and contour maps

由图6a可以看出,洗脱剂体积分数曲面较陡，表明洗脱剂体积分数对箬叶总黄酮的解吸率影响显著；而洗脱流速曲面平缓，说明洗脱流速对解吸率影响不太显著。从等高线图上可看出，沿洗脱剂体积分数轴向等高线变化密集，而洗脱流速轴向等高线稀疏，说明洗脱剂体积分数对解吸率的峰值影响比洗脱流速大。

由图6b可以看出,洗脱剂体积分数和洗脱剂用量的曲面都较陡，表明洗脱剂体积分数和洗脱剂用量对箬叶总黄酮的解吸率影响显著。从等高线图上可看出，沿洗脱剂体积分数轴向等高线变化密集，而洗脱剂用量轴向等高线相对稀疏，说明洗脱剂体积分数对解吸率峰值影响较洗脱剂用量大，等高线呈椭圆形，说明洗脱剂体积分数和洗脱剂用量间的交互作用较强[15-16]。

由图6c可以看出,洗脱剂用量曲面较陡，表明洗脱剂用量对箬叶总黄酮的解吸率影响显著，而洗脱流速对解吸率的影响则不太显著。从等高线图上可看出，沿洗脱剂用量和洗脱流速轴向等高线变化都不太密集，等高线呈椭圆形，说明洗脱剂用量和洗脱流速间的交互作用较强。

2.4.3回归方程及验证实验

对回归方程取一阶偏导数等于0，整理可得如下方程：

2.37789+0.10413B-0.15325C-0.025586A=0

17.10325+0.10413A+2.68750C-12.37900B=0

39.80475-0.15325A+2.68750B-8.54400C=0

联立以上方程组解得A=80.83、B=2.93、C=4.01,对应的实验条件为：洗脱剂体积分数80.83%、洗脱流速2.93 BV·h-1、洗脱剂用量4.01 BV。采用最优纯化条件进行验证实验，为便于实验进行将纯化条件修改为：洗脱剂体积分数80%、洗脱流速3 BV·h-1、洗脱剂用量4 BV，3次平行实验得到的吸附容量为11.09 mg·g-1，解吸率为84.62%，与响应面法实验所得解吸率85.75%相差不大。

3结论

HPD-800树脂对箬叶总黄酮的吸附容量大，易于解吸，适合于对箬叶总黄酮的分离纯化。响应面法实验得到的最优纯化工艺条件为：吸附过程：常温，pH值9，流速1.0 mL·min-1，上样液浓度2.3 mg·mL-1；解吸过程：4 BV 的80%乙醇以3 BV·h-1流速进行洗脱。在上述条件下HPD-800树脂对箬叶总黄酮的吸附容量为11.09 mg·g-1，解吸率为84.62%。表明，采用HPD-800树脂对箬叶总黄酮的纯化效果好，可以考虑应用到工业生产中。

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10.3969/j.issn.1672-5425.2015.12.008

Optimization on Purification Process of Total Flavonoids from Indocalamus

Leaves with Macroporous Resins by Response Surface Methodology

ZUO Li-yun，ZHAO Chun，YUE Wei，JI Rui-dong，SUN Wen，WU Shi-jun

(Wuhan Technology and Business University，Wuhan 430065,China)

Abstract：Total flavonoids from indocalamus leaves were purified by macroporous resins.The optimal macroporous resin was choosen by static adsorption-desorption experiment.Based on dynamic adsorption-desorption experiment，the purification process of total flavonoids from indocalamus leaves with macroporous resins was optimized by response surface methodology.Results showed that，resin HPD-800 had higher adsorption capacity，the pH value of sample solution was 9,the concentration of sample solution was 2.3 mg·mL-1，the flow rate of sample was 1.0 mL·min-1.When using 4 BV ethanol(volume fraction of 80%) as eluent with 3 BV·h-1，the desorption rate was 84.62%.

Keywords：hydrotalcite-like;octyl betaine;cyclohexanone;dehydrogenation;catalytic performancedoi：

中图分类号：TQ 028R 284.2

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2015)12-0033-05

通讯作者：

作者简介：左丽云，女，湖北广水人，研究方向：天然产物提取与分离；乐薇，副教授，E-mail：yuewei11@126.com。

收稿日期：2015-09-19

基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(2013C111)，武汉工商学院大学生科技创新项目(S201415)