刘卫东，叶英响*，杨洁红



曲妥珠单抗对心肌细胞损害作用的实验研究

刘卫东1，叶英响1*，杨洁红2

目的 探讨曲妥珠单抗对大鼠心功能的影响及其作用机制。方法50只6周龄SPF级SD大鼠随机均分为观察组和对照组。观察组大鼠腹腔注射曲妥珠单抗，共计给药7 d；对照组大鼠腹腔注射生理盐水，体积与注射时间同观察组。分别于给药前后用心脏超声检查大鼠心功能变化；采用TUNEL技术检测细胞凋亡情况，同时检测大鼠心肌细胞Caspase-3活性。结果给药1周后，观察组大鼠LVEDd、LVESd显著扩大，LVPWDd、LVPWSd明显变薄，LVEF、LVFS显著降低，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。给药1周后，观察组凋亡指数(AI)显著增加，Caspase-3活性显著增强，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论曲妥珠单抗会导致心肌细胞损害，其机制可能与激活Caspase-3、促进心肌细胞凋亡有关。

曲妥珠单克隆抗体；心功能；凋亡

0 引言

曲妥珠单抗(赫赛汀)是抗人体表皮生长因子受体-2(Her-2)的单克隆抗体，其通过附着在Her-2上阻止人体表皮生长因子在Her-2上的附着，从而阻断癌细胞的生长。1998年FDA批准曲妥珠单抗用于Her-2过度表达的乳腺癌治疗，极大程度降低了乳腺癌的复发率和死亡率，目前曲妥珠单抗已经成为乳腺癌治疗的主要靶向治疗药物。然而在临床应用中关于曲妥珠单抗所致心脏不良反应的报道较多，主要集中于导致患者左心室收缩功能降低。Morris等[1]报道，应用曲妥珠单抗后，患者可能出现无症状心力衰竭或有症状心力衰竭等。也有报道，单一使用曲妥珠单抗引起心力衰竭的发生率约为2.5%～4.7%[2]，但是关于其具体作用机制目前尚不清楚。本研究给予大鼠腹腔注射曲妥珠单抗，观察其对大鼠心功能的影响，探讨曲妥珠单抗所致心脏损害的可能作用机制，以期为临床预防、治疗提供参考，现总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 50只6周龄SPF级SD大鼠购自本院动物实验中心，实验前对动物进行称重，大鼠体重(158.4±7.9)g。将50只大鼠按随机数字表法分为观察组和对照组，每组25只。两组大鼠分笼饲养，自由饮食，控制室温18～25 ℃。

1.2 方法

1.2.1 给药方法 观察组大鼠腹腔注射曲妥珠单抗：曲妥珠单抗针(赫赛汀，440 mg/20 mL)稀释至22 mg/mL，并于4 ℃保存；首次给药剂量12 mg/mL，从第2天开始剂量调整为6 mg/mL，连续注射7 d，总给药量为48 mg/mL。对照组大鼠腹腔注射生理盐水，体积与注射时间同观察组；两组大鼠注射量按照大鼠体重每3天调整1次。同时每日观察大鼠活动情况、饮食量、体重及皮毛色泽变化。

1.2.2 心功能检测 分别于首次给药前、最后1次给药后腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，并将大鼠固定于操作台上，用彩色多普勒超声仪进行检测，检测指标包括：舒张末期左心室后壁厚度(LVPWDd)、舒张末期室间隔厚度(IVSDd)、收缩期左心室后壁厚度(LVPWSd)、收缩期室间隔厚度(IVSSd)、左心室舒张末期内径(LVEDd)、左心室收缩末期内径(LVESd)、左心室舒张末期容量(EDV)、左心室收缩末期容量(ESV)，并计算各组大鼠左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS)。各指标检测5次，取平均值。

1.2.3 心肌细胞凋亡检测 最后1次麻醉后，在冰台上将大鼠左心室组织切取，部分用中性甲醛浸泡，剩余部分用液氮冷冻后于-80 ℃冰箱中保存待检。取左心室3个不同部位做常规石蜡切片，采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)对细胞凋亡进行检测：将样本TUNEL染色后，再于高倍镜下对每张切片随机选择5个视野，记录每个视野中总心肌细胞核数与凋亡阳性细胞核数，其中凋亡指数(AI)=凋亡阳性细胞核数/总心肌细胞核数×100%。

1.2.4 Caspase-3活性检测 将心肌细胞裂解后，提取总蛋白。BCA蛋白浓度测定试剂盒检测心肌细胞组织总蛋白浓度；再按照Caspase-3活性荧光检测试剂盒检测Caspase-3活性；以标准误浓度作为横坐标、吸光度(OD值)作为纵坐标，通过绘制标准曲线计算样品浓度，再用蛋白浓度校正即得Caspase-3活性。

1.3 统计学方法 所有数据采用SPSS 16.0统计学软件包进行统计分析，计量资料以表示，组间比较采用t检验，多组间数据比较采用方差分析或秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠心脏超声检查结果比较 两组大鼠给药前心功能各指标比较差异无统计学意义(P>0.05)；给药1周后，观察组大鼠LVEDd、LVESd显著扩大，LVPWDd、LVPWSd明显变薄，LVEF、LVFS显著降低，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 两组大鼠TUNEL染色、Caspase-3活性检测结果 给药1周后，观察组AI增加，Caspase-3活性增强，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 两组大鼠心脏超声检查结果比较

表2 两组大鼠TUNEL染色、Caspase-3活性检测结果

3 讨论

约有25%的乳腺癌患者的Her-2呈高表达。研究显示，Her-2阳性的乳腺癌具有高侵袭性，且预后较差，临床治疗难度较高[3]。曲妥珠单抗是1998年开始由FDA批准用于抗Her-2的靶向治疗药物，该药显著提高了Her-2阳性乳腺癌患者的远期生存率和生活质量。李伟等[4]单用曲妥珠单抗治疗Her-2阳性中晚期乳腺癌患者，其有效率、中位无进展生存期、总生存期显著提高。Korkaya等[5]也证实，曲妥珠单抗联合阿霉素、紫杉醇能够显著提高乳腺癌患者的完全缓解率。上述研究均提示，联合曲妥珠单抗的一线化疗方案能够显著提高抗肿瘤的效果。但是国内外关于曲妥珠单抗用药后诱导心功能损害的报道越来越多。Caussa等[6]发现，在采用曲妥珠单抗治疗后，约有3%～9%的患者会出现不同程度的心脏不良反应。但是报道多见于临床观察。虽然Costantini等[7]对小鼠腹腔注射曲妥珠单抗后，发现小鼠心肌细胞出现病理性损害，但是其具体作用机制仍不清楚。因此，研究曲妥珠单抗所致心功能损害发病机制对降低药物的不良反应有着重要意义。

黄平等[8]分别对给予曲妥珠单抗化疗前后的患者进行心电图检查，结果显示，化疗6个月后，患者舒张期、收缩期左心室容积显著增加，舒张末期和收缩末期左心室直径显著扩大，左心室射血分数和短轴缩短率也明显降低。本研究对健康大鼠分别腹腔注射曲妥珠单抗和生理盐水，结果显示，给药1周后，观察组大鼠LVEDd、LVESd显著扩大，LVPWDd、LVPWSd明显变薄，LVEF、LVFS显著降低，与给予曲妥珠单抗治疗后患者的心功能表现基本相符。蒽环类抗肿瘤药物对心肌细胞也有损害作用，可导致Ⅰ型心肌损害[9]，这种损害是不可逆的。而Russell等[10]报道，曲妥珠单抗为Ⅱ型心肌损害，往往出现于用药3个月后，这种心肌损害均为可逆性，一旦撤药心肌功能会重新恢复。因此。在临床中，需要区别对待曲妥珠单抗与蒽环类抗肿瘤药物所致的心功能异常。

本研究显示，与对照组相比，给药1周后，观察组AI显著增加，Caspase-3活性显著增强。Chen等[11]报道，心肌细胞凋亡会引起左心室舒张功能障碍，通过抑制心肌细胞的凋亡能够改善心室重构，表明曲妥珠单抗引起的心功能降低与心肌细胞凋亡有关。Her-2作为酪氨酸激酶参与细胞的增殖、分化[12]。Posch等[13]研究显示，Her-2能够维持心肌细胞功能完整性，Her-2受体激活会导致心肌细胞肥大或扩张性心肌病。推测曲妥珠单抗所致心肌细胞凋亡与抑制Her-2受体有关。韩冬等[14]证实，Her-2受体受到抑制后，会促进Bcl-xS表达，降低Bcl-xL表达，自动启动细胞内线粒体凋亡途径，导致细胞内线粒体功能异常，细胞正常能量代谢障碍，最终发展成心肌细胞凋亡。Caspase-3是细胞凋亡的执行基因，多种细胞凋亡途径最终通过激活Caspase-3而实现。因此，笔者认为，曲妥珠单抗会激活Caspase-3，进而参与Her-2受体抑制过程，最终导致心肌细胞凋亡。综上所述，曲妥珠单抗会导致心肌细胞损害，其机制可能与激活Caspase-3、促进心肌细胞凋亡有关。但是由于曲妥珠单抗所致心脏毒性机制较为复杂，且Caspase-3介导的凋亡途径较多，因此其具体机制仍需要进一步研究。

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Experimental study on the effect of trastuzumab on the damage of myocardial cells

LIU Wei-dong1,YE Ying-xiang1*,YANG Jie-hong2

(1.Department of Pharmacy,Yiwu Central Hospital,Yiwu 322000,China; 2.Basic Medical College of Zhejiang Chinese Medicine Univefrsity,Hangzhou 310053,China)

Objective To explore the effects and mechanism of trastuzumab on cardiac function of rats.Methods50 SD rats were randomly divided into observation group (n=25) and control group (n=25),rats in observation group were injected with trastuzumab for 7 d; rats in control group were intraperitoneally injected with physiological saline,with the same volume and injection time as observation group.The cardiac function was detected by cardiac ultrasonography before and after injection,TUNEL technique was used to determine the cell apoptosis,and the myocardial cell Caspase-3 activity was detected.ResultsThe LVEDd,LVESd of rats in observation group significantly expanded at 1 weeks after administration,and the LVPWDd,LVPWSd were significantly thinner,LVEF and LVFS significantly reduced,there were significant differences between the two groups (P<0.05).The apoptosis index of observation group increased,and the Caspase-3 activity enhanced(P<0.05).ConclusionTrastuzumab can lead to myocardial cell damage,and the mechanism may be related to the activation of Caspase-3 and promoting myocardial cell apoptosis.

Trastuzumab; Cardial function; Apoptosis

2014-10-27

1.浙江省义乌市中心医院药剂科，浙江 义乌322000；2.浙江中医药大学基础医学院，杭州 310053

国家自然科学基金(81073139)

10.14053/j.cnki.ppcr.201505008

*通信作者